生物制药开发中的物性评估技术：配方研究
我们介绍了生物制药开发各阶段中需要评估的项目，以及马尔文·帕纳利提卡尔可进行评估的测量技术。在此页面中，我们将详细介绍“配方研究”。
使用扩散系数评估分散稳定性（DLS）
从抗体的浓度依赖性来看不同配方条件下的扩散系数比较
在生物制药中，通过在浓度上绘制动态光散射法（DLS）得到的扩散系数，就可以评估分散稳定性。下图是将IgG抗体分散在不同缓冲液中，通过DLS测量浓度变化对粒径变化的结果。
在缓冲液1（上图左），可以看到浓度升高，粒径变大，扩散系数变小。相反，在缓冲液2（上图右），粒径缩小，扩散系数变大。这是因为分子间相互作用的斥力显著增加了缓冲液2中的扩散系数。下图是浓度对扩散系数的绘图。当直线的斜率为负（蓝色）时，分散稳定性低，斜率为正（红色）时，分散稳定性高且聚集体少。
由此可见，使用DLS可以评估不同配方条件下样品的分散稳定性。
通过第二维里系数评估分散稳定性（SLS）
从样品浓度依赖性来看不同配方条件下的第二维里系数比较
静态光散射法（SLS）是光散射法的一种，可以求得样品的分子量和第二维里系数（B22），通过这些参数可以暗示分散稳定性。上面是通过SLS评估不同浓度NaCl缓冲液中溶菌酶的分散稳定性。对每个NaCl浓度，改变蛋白质浓度来绘制KC/Rθ图（Debye图），从其斜率得到B22。这个参数表示溶质和溶剂的关系，通常B22为正则暗示该蛋白质的分散性稳定。因此，认为溶菌酶在含0% NaCl的缓冲液条件下分散稳定性高。
下图比较了不同缓冲液中相同抗体的B22。结果表明，高分散稳定性的是缓冲液2。
因此，使用SLS可以评估考虑不同配方条件下分散稳定性的蛋白质。
利用电导光散射法评估分散稳定性（ELS）
不同配方条件下的抗体Zeta电位比较
一种分散性指标——Zeta电位，可以通过电泳光散射法（ELS）获取，取决于分子及其周围环境（缓冲液类型）。下图显示了在不同缓冲液中的IgG的Zeta电位比较结果。由于在ELS中盐浓度设定较高，测量容易不稳定。因此，通过多次测量来确认再现性。在缓冲液1（蓝色）中，Zeta电位较低，由电泳迁移率计算得出的电荷（数据未显示）也为0.8，表明分散稳定性低，表面静电相互作用显着。缓冲液2（红色）中，Zeta电位和电荷为6.5，表明静电稳定性高。
因此，通过ELS可以评估不同配方条件下分子表面相互作用所导致的分散稳定性差异。
Tm和Tagg为指标的热稳定性评估（DLS）
比较10种不同配方条件下重组蛋白的热稳定性
在药物有效成分（API）的开发中，设计在推荐的处理条件下在长期储存中提供足够稳定性的制剂是很重要的。
在DLS中，通过升温条件下的粒径变化，获得开始聚集的温度（Tagg），可以评估各种溶剂条件下的热稳定性。高热稳定性条件被认为在长期储存中也同样稳定。下图是在不同pH条件下制备的不同缓冲液中重组蛋白的DLS升温测量结果。大多数使用pH 3至10制备的样品表现出相似的Tm （67至68℃）。用pH 6制成的两个样品（红框），直到Tm超过74℃才开始聚集，显示出最高的热稳定性。相对地，用pH 3（绿色）和4（黄色）制成的两个样品在升温开始时粒径较大，可能已经处于变性状态。
因此，通过在DLS中进行升温测定，可以评估不同配方条件下的热稳定性。
Tm和T1/2为指标的热稳定性评估（DSC）
比较19个不同配方条件下抗体的热稳定性
通过将生物制剂的处方条件（缓冲液种类、pH、添加剂等）在各种溶液中的样品热稳定性进行差示扫描量热法（DSC）比较，可以缩小范围。 上图数据是在pH不同的三种溶液条件下比较的相同抗体的DSC数据。pH 3.5时主峰位置相较pH 5.5和6.2位置偏低，变性开始温度也较低，可以看出热稳定性较低。中段图是在19种不同缓冲液和pH条件下对某抗体进行DSC测量，比较主峰的变性温度（Tm）。从Acetate 5.0到 Tris 7.5共12种条件显示出几乎相同的Tm（中段红色箭头），可以作为候补的处方条件。通常利用此方法可缩小制剂条件的范围，此外，下段图中比较调整后立即的抗体（蓝色）与经过1周的抗体（黄色），主峰高度的1/2温度范围（T1/2）。 T1/2的温度范围越窄，结构越紧凑，稳定性越高，进一步缩小了较Tm更为严格的条件（下段红色箭头）。
因此，通过DSC获得的多个参数对不同缓冲液条件下的样品的热稳定性进行比较，可以更好地决定处方条件。
通过散射光定量分析蛋白质聚集体（NTA）
在药物开发中，检测和定量SVP（可见异位颗粒）是非常重要的。
通过纳米粒子跟踪分析（NTA），激光直接照射液体中的粒子，通过捕捉其散射光的摄像头，能够检测在光学显微镜下不可见的次微米-纳米尺寸粒子，最小可检测至10 nm*。同时，通过对液体内的布朗运动进行图像处理跟踪，从而根据速度计算粒径。能够检测到50 nm以上的蛋白质聚集体，可以填补显微镜、流式细胞仪和色谱分析范围之间的空隙。
下图展示了在缓冲液中的蛋白质中可以聚集到能够检测到散射光的粒子的浓度。横轴是尺寸，纵轴是粒子计数。
因此，通过NTA来检测，用之前的手段难以检测的聚集体可以通过可视效果确认，支持更好的处方决策。 *依赖于粒子的材料和密度
通过散射光定量评估不同配方条件下的SVP（NTA）
添加4种不同抗氧化剂后胰岛素的SVP检测
在NTA中，由于测定区域是已知的，因此可以计算SVP的粒子浓度。下图是将1 mg/mL胰岛素与各种抗氧化剂100 μM一起，在4℃下保存72小时的样品，进行SVP分析的结果。横轴是尺寸，纵轴是粒子数量。在不含抗氧化剂的PBS中的胰岛素（A），检测到SVP的浓度低。根据所添加的抗氧化剂，聚集的粒子数量多的（B、D、E）和少的（C）之间存在差异。
因此，利用NTA可以对不同配方条件下的SVP含量进行定量评估，支持更好的处方选择。
通过粒径分布变化评估热稳定性（DLS）
向Con A中添加不同的4种糖进行加速实验的尺寸变化比较
在DLS中，可以对蛋白质制剂中添加剂加入后的热稳定性进行评估。
下图是1 mg/mL的刀豆球蛋白A（Con A）中添加了各种糖（10 mM）后，通过DLS进行升温测量的结果，观察这些糖的结合如何影响热稳定性。横轴是尺寸，纵轴是光强度分布（Intensity%）。在35℃上层，加热状态下保持单分散状态，峰顶位置也一致。而在下层47℃状态，不同糖的聚集状态（大小、数量）有差异。
主要峰在10 nm附近的状态中，没有糖（浅紫）和半乳糖（绿色）粒径已经扩大并聚集，而葡萄糖（蓝色）、果糖（黑色）、甘露糖（红色）结合在一起，增强热稳定性。
因此，通过DLS可以通过尺寸变化评估不同添加剂对热稳定性的影响，帮助更好的制剂决定。
以尺寸变化作为指标的稳定性评估（SEC-LS）
通过加速实验确认抗体结合、聚集和碎片化
作为加速实验中蛋白质制剂的稳定性评估，常使用尺寸排除色谱（SEC）。
下面的图示为将IgG抗体置于小瓶中，在水浴中加热样品后，通过SEC进行测量的结果。与调节后立即（红色）和保持60℃ 135分钟的结果（紫色）相比，后者的单体比例较大，二聚体比例较小。60℃保持60小时的样品（绿色）显示出聚集加速，确认到更大的聚集体（红色箭头：RV 6 mL附近）。还确认到单体峰后半段（黄色箭头：RV 10 mL附近）出现峰，也发生了碎片化。
因此，通过SEC可以进行加速实验产生的样品因稳定性而导致的聚集和碎片化评估，支持更好的制剂决定。
| 分子量（Da） （含量（%）） | ||||
| 聚集体 | 二聚体 | 单体 | 不明物 | |
| 开始时 | 654,500 (4.5) | 294,500 (14.3) | 147,100 (81.2) | ― |
| 60℃ / 135分钟 | 547,100 (1.8) | 293,500 (5.2) | 145,900 (93.0) | ― |
| 60℃ / 60小时 | 3,081,000 (1.2) | 588,400 (9.6) | 156,800 (75.0) | 133,400 (17.2) |
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