生物医药品开发中的物性评价技术：候选选择

我们为您介绍了生物医药品开发各阶段中需要评估的项目，以及可以通过马尔文·帕纳利帝科的测量技术进行评估的项目。在这一页面，我们将详细介绍“候选选择”。

通过粒径分布对粒径确定及聚集、凝集体的评估（DLS）

血红蛋白的尺寸测量

从众多候选者中快速高效地筛选出目标样品是至关重要的。动态光散射法（DLS）可以在几分钟内判断样品粒子的大小和分散状态，迅速判断聚集或凝集体的混入。下图的横轴表示尺寸（流体力学半径），纵轴表示光强度分布（Intensity(%)），测量了不同种类血红蛋白的粒径分布。从表中可以看出，散射强度基准值为100%的HbA（蓝色）和铜氰蛋白（黑色）表现为单一峰，而基准值下降的Rice Hb1（绿色）和Polytaur（灰色）的粒径分布较宽，粒径较大的分子混存。

利用DLS，可以通过确认粒径和峰面积比来识别样品中单体、二聚体及更高次寡聚的比例。此外，DLS还能够根据粒径信息推测分子量，并有效用于确定样品中寡聚状态和凝集体比例。

多个检测器用于准确的分子量和结构信息的评估（SEC-LS・Vis）

apo-RD和holo-RD的评估

使用基于标样保持容量的传统解析法时，由于蛋白质构造变化导致的视体积增大可能导致分子量误判。通过将光散射检测器（LS）连接到尺寸排阻色谱（SEC）上进行光散射分析有助于得到准确的分子量。下图显示了在有（holo）和无（apo）CaCl₂的条件下，测量与Ca离子结合而改变结构的Repeat in Toxin Domain（RD）蛋白的SEC测量结果。比对holo（实线）和apo（虚线）状态，传统方法中apo由于溶出时间较早可能被解析为约600 kDa，而holo为73kDa。但通过使用光散射解析，结果显示两者的分子量约73kDa。同时，粘度检测器测得apo的固有粘度为0.35 dL/g，而holo为0.055 dL/g，展示了不同特性。这意味着Ca离子存在时，蛋白质会发生结构变化。

因此，通过多个检测器同时测量，可以获得准确的分子量和结构信息，从而避免构建选择时的误导。

利用多个检出器对粒径的测定和聚集、凝集体的评估（SEC-LS・Vis）

抗体的纯度评估

光散射越强，其分子量越大。当将光散射检测器连接到SEC上时，可以清晰看到RI或UV/VIS检测难以分辨的凝集区域。下图展示了使用RI检测器和光散射检测器测得的IgG的结果。单体、二聚体可以通过RI信号（红色）和光散射信号（橙色）确认，但在凝集区，光散射信号明显大于RI信号（红色箭头）。RI或UV/VIS检测器依赖于浓度，凝集体量小会导致信号较小。通过增加光散射检测器，可以判断凝集是否确实存在或只是基线波动。

使用SEC-LS・Vis，可以更准确地确认样品的纯度，从而选择出更高纯度、理想的构建。

通过热稳定性比较进行构建选择（DSC）

比较了12种Fab突变引入抗体的热稳定性

众所周知，蛋白质活性和稳定性会因突变而变化，稳定性的提升也会影响活性。差示扫描量热法（DSC）可以不需标记对蛋白质热稳定性进行评估。下图是通过DSC测量的破伤风类毒素识别抗体的野生型（WT）和12种Fab突变体的数据。横轴为温度，纵轴为变性所需的热容量。WT Fab的T_m（主峰顶温度）为78.7℃，而突变型V11为92℃，显示出增加了13.3℃的稳定性。

通过DSC，可以比较抗体可变区的细微序列差异对热稳定性的影响，从而缩小到更稳定的构建候选。

通过绑定活性进行构建选择（ITC）

组蛋白伴侣与不同的三种组蛋白肽的相互作用

在药物开发中，选择对靶蛋白具有更高亲和力的候选者是非常重要的。等温滴定量热法（ITC）可以一次测量求得分子间相互作用的亲和性、特异性和结合机制。

下图比较了组蛋白伴侣TAF3(TBP(TATA绑定蛋白)-相关因子)的PHD域（植物同源域）与不同的三种组蛋白肽（10-mer）的相互作用。上方为测量的原始数据，下方的横轴为摩尔比，纵轴为相互作用中产生的焓变（△H）。这些相互作用皆显示单一的S型曲线，是典型的1:1结合，通过拟合分析显示每种肽的亲和性不同。亲和性的区别反映在曲线的斜率上，斜率越接近垂直，亲和性越强，斜率越趋于平缓，亲和性越弱。

通过ITC，可以选择出更高亲和性的构建。

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