最佳实践：使用等温滴定量热法研究结合相互作用——第 3 部分

by Verna Frasca, Tuesday, 19th March 2019

以下是使用 MicroCal PEAQ-ITC， VP-ITC 和 iTC200 系统进行传统结合实验的一些最佳实践。这是之前博客“最佳实践：使用等温滴定量热法研究结合相互作用”第 1 部分 和 第 2 部分 的延续。

定期对您的 ITC 进行性能和验证检查

  • 水-水注射
  • 含 RNase 和 EDTA 的 ITC 测试套件
  • 其他参考结合实验

在结合实验之前，尽可能进行控制滴定

  • 检查稀释热和其他热源的变化
  • 典型的控制滴定是在 ITC 注射器中加入配体，与匹配的缓冲液滴定，使用与结合实验相同的 ITC 实验参数
  • 控制滴定的热变化应小，可重复，并类似于结合实验结束时的热变化（图 1，顶部）
  • 其他控制滴定是在 ITC 单元中进行的缓冲液-缓冲液和缓冲液-大分子滴定

图 1：（顶部）原始 ITC 数据，其中控制滴定（配体-缓冲液）（红色），结合实验（配体-大分子）（黑色）。注意，控制滴定的峰形和大小与结合实验的最终注射相似。

（底部）标准化热变化，其中控制滴定（红色）和结合实验（黑色）。数据符合单组位点结合模型。

对 ITC 原始数据的评估：理想 ITC 实验（1:1 结合事件）的原始数据是什么样子

参见图 1 和图 2。

  • 滴定数据曲线从一系列大约相等的、大的峰（放热或吸热）开始，代表接近 100% 的配体对大分子的结合
  • 随着实验中配体的进一步注射，结合位点逐渐被饱和，热变化减少
  • 在结合完全饱和后配体的稀释热峰相对较小且可重复（图 1 和图 2）
  • 这种滴定曲线将产生一个 S 形的结合等温线（图 1 底部）
  • 需要足够超过基线噪音的热变化来获取高质量的 ITC 数据
  • 注射热（积分面积）：
    • 对于 PEAQ-ITC 和 ITC200：第二个（第一个完整）峰的热量需大于 2.5 微卡是理想的
      • 第二个峰约 1 微卡是数据分析的最低热量
    • 对于 VP-ITC：第二个（第一个完整）峰的热量需大于 10 微卡是理想的
      • 第二个峰约 3-5 微卡是数据分析的最低热量
    • 低于此热检测范围的数据可能由于较低的信噪比而较为嘈杂
  • 原始 ITC 数据的基线位置（以微卡/秒计）应在参考功率设置的 1 微卡/秒以内。如果差值大于 1 微卡/秒，这可能表示 ITC 单元脏污和/或参考或样品单元中存在气泡
  • 原始 ITC 数据的所有 DP 值（Y 轴）应高于 0 微卡/秒
  • 注射后的基线位置应与注射前的基线相同。如果不是，则可能注射间的时间不够，或者有其他过程导致 DP 变化，如酶促水解
  • 整个滴定过程中基线略有漂移是正常的。如果基线积分良好，那么数据没问题（图 2）。您不希望在基线上有大的跳跃或“步进”

图 2. 高质量 ITC 数据。注意积分基线的轻微漂移（红色）——这是可以接受的。

关于 ITC 曲线拟合中 N 值的更多信息

N 值与总大分子浓度相关，是数据分析时确定的参数之一。重要的是要理解 ITC 中的 N 值并不总是等同于配体与大分子的化学计量（结合比）。如果我们用于拟合的浓度是正确的并且 100% 有效，那么 N 值实际上等于化学计量。

另一种表达 N 值的方式是此方程：

N = St x [AFcell/AFsyr]

其中 St 是化学计量（大分子对配体的结合位点数目），AF 是生物分子的“活性部分”（活性浓度除以总浓度），AFcell 是单元中样品的活性部分（通常是大分子），而 AFsyr 是注射器中样品的活性部分（通常是配体）。

此公式中的任何三个值之一都可以更改 N，这意味着 N 是结合比及样品活动性的度量。有两个值必须是已知的（或假定的）才能得到第三个。例如，如果对化学计量感兴趣，则拟合中提供的浓度必须准确且 100% 活动。如果对大分子样品的活性感兴趣，那么需要假定化学计量和注射器中样品（配体）的活性浓度。

在 PEAQ-ITC 数据分析软件包中，您也可以通过将 N 固定为 1（或期望值）并改变单元或注射器浓度来拟合数据。

如果 N 低于预期化学计量，说明单元中的大分子活性浓度低于总浓度，和/或注射器中的配体活性浓度高于总浓度。

如果 N 为 0.5，可能是您的大分子（在 ITC 单元中）是二聚体，并且每个二聚体结合一个配体。也有可能注射器中的生物分子有 2 个结合位点，而单元中的样品有一个结合位点，因此您应该尝试使用“配体在单元中”选项拟合结合曲线。

如果 N 高于预期化学计量，说明单元中的大分子活性浓度高于总浓度，和/或注射器中的配体活性浓度低于总浓度。

注射器中配体浓度的误差将导致 N、KD 和 ΔH 的测量误差，进而影响结合的自由能（ΔG）和熵（-TΔS）贡献。单元中大分子浓度的误差主要影响确定的 N 值的准确性。

相关内容

以往文章

“`

这篇文章可能已被自动翻译