最佳实践：用于研究结合相互作用的等温滴定量热法 – 第1部分

以下是使用 MicroCal PEAQ-ITC、VP-ITC 和 ITC200 系统进行传统结合实验的若干最佳实践。

样品要求：

• • 根据惯例，“大分子”是等温滴定量热计（ITC）细胞中的生物分子，“配体”是 ITC 注射器中的生物分子。这些可以是相互作用的任何分子（蛋白质、核酸、小分子抑制剂、金属等）。也可以进行“反向滴定”，即将“配体”放入注射器中。
  • “配体”有一个结合位点，用于一个结合位点集的结合模型的数据分析以及其他常用的 ITC 数据分析模型。“大分子”可以有任意数量的结合位点。
  • 所有样品应尽可能为 ITC 纯化。避免或消除化学和构象杂质，因为这些可能影响准确的浓度测定，可能参与或干扰结合相互作用。
  • 为了获得高质量的ITC数据，两个生物分子必须在所需的缓冲液中匹配，以避免由于缓冲液不匹配带来的热量变化。

• ITC 的缓冲液：
  • 使用可以维持生物分子溶解度和稳定性的缓冲液，并包含结合所需的任何盐、辅因子和添加剂。
  • 作为起始点，您可以使用用于其他结合研究的相同缓冲液。
  • ITC可与pH2至pH12之间的水溶性缓冲液兼容。确保缓冲液浓度足以在存在生物分子的情况下维持pH值。
  • 如果缓冲液含有甘油（或其他粘性成分），保持甘油浓度低于20%（v/v），以避免在ITC细胞和注射器中产生气泡。
  • 如果缓冲液含有表面活性剂或洗涤剂，应保持表面活性剂浓度低于其临界胶束浓度（CMC），除非您在研究ITC中的胶束。
  • 如果需要还原剂，我们建议使用TCEP或2-巯基乙醇。不推荐使用二硫苏糖醇。
  • 如果配体需要DMSO以增加溶解度，请确保在两种结合伙伴中具有相同的最终DMSO浓度。对于ITC结合研究，推荐的DMSO上限为10%。
  • 如果您需要使用其他有机溶剂，请检查仪器的技术文献，或咨询您所在地区的Malvern Panalytical支持团队，以获得建议和您ITC系统的化学兼容性。

样品体积：

• 请参阅表1。这些是根据推荐的协议填充ITC 细胞和注射器所需的推荐体积，没有添加气泡。

样品浓度：

• ITC 细胞中的起始大分子浓度通常由“C 参数”或“sigmoidocity 因子”决定，确定如下：
  C= N[M]_T/K_D       
• [M]T 是 ITC 细胞中的大分子浓度，N 是化学计量数。为了获得合理的 ITC 结合等温线，最佳范围是 5 < C < 500。在许多情况下，当 C 在 1 到 1000 之间时，您可以从 ITC 结合曲线中获得有用的数据。
• 对于 1:1 结合，使用 ITC 注射器中的配体浓度比 ITC 细胞中的大分子浓度高 10 倍作为起始浓度。
• 如果您有估计的 K_D，且存在 1:1 结合，请使用表 2 中的指南。假设有合理的热变和结合焓，这些浓度范围应该给出结合曲线。
• 如果 K_D 未知，尝试在 ITC 细胞中使用 20 μM 样品，在 ITC 注射器中使用 200 μM 样品。
• ITC 细胞中的最低浓度：5-10 μM
• ITC 注射器中的最低浓度：50 μM

表2：如果您有估计的 K_D 且存在 1:1 结合，ITC 实验的推荐浓度[/caption>

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