最佳实践：使用等温滴定量热法研究结合相互作用 – 第4部分

by Verna Frasca, Thursday, 18th April 2019

以下是使用 MicroCal PEAQ-ITC，VP-ITC 和 iTC200 系统进行传统结合实验的一些最佳实践。这是之前博客文章“使用等温滴定量热法研究结合相互作用”的延续，第1部分，第2部分 和 第3部分。

ITC 原始数据的常见问题及可能原因

  • 由于稀释热大，导致注入热量大：

    • 这通常是由于大分子和配体溶液的不匹配，其远大于实际结合热。
    • 结合等温线通常看起来像一条直线，没有结合饱和的迹象。
    • 通常，这种大热量变化无法通过减去控制滴定来纠正。

  • DP在下次注入前未返回至预注入基线。

    • 这可能是由于注入间时间不足以完全测量结合热。
    • 并不是每次注入都能测量到所有的热量变化，影响数据质量。调整注入量，减少配体浓度，和/或增加注入间的时间。
    • 如果在实验中注意到这一效果，可以增加剩余注入间的间隔。
    • 也有可能是另一个（较慢的）过程引起热量变化，比如构象变化。

  • 注入中的尖峰，某些峰比其他峰大得多（或小得多）：

    • 由ITC池和/或注射器中的气泡引起，或是ITC注射器中的柱塞尖端脏污或损坏。

  • 噪声基线和/或注入间的尖峰：

    • 由于池和/或注射器填充不良、细胞和/或注射器脏污导致的气泡。
    • 还可能是由于注入针弯曲或注入系统的问题。

  • 阶梯基线：系统的热容由于酶水解、pH值或缓冲液不匹配而改变：

    • 如果在研究底物和酶之间的结合，使用不易水解的底物。
    • 阶梯基线也可能是由于ITC池或注射器中的气泡导致的，通常是由于填充不足。

  • 未检测到结合热：

    • 无结合发生。
    • 可能正在发生结合，但热量变化太低。结合焓可能低于预期，和/或结合亲和力弱于预期。
    • 要增加热量变化/注入，需要增加大分子和/或配体的浓度；增加注入量，和/或改变实验条件，如实验温度或缓冲液/pH值。

在数据分析前校正稀释热

  • 如在之前博客中所讨论，大分子和配体溶液的紧密匹配对于避免大的稀释热非常重要，因为它可能会掩盖实际的结合信号。这些与结合无关的热量需要从大分子-配体滴定结合等温线中的每个点中减去，然后进行进一步的数据分析。这可以通过多种方式实现：
  • 稀释热的估计可以直接从实验滴定中取得，方法是平均化与最后几次注入相关的积分热量。这个减去过程可以使用 Origin 数据分析中的“简单数学”选项来完成。这种方法假定在ITC实验结束时，结合位点已经完全被配体饱和。
  • 对于PEAQ-ITC，在数据分析过程中还可以使用“配合偏移”选项来校正稀释热。
    • 如果有配体溶液进入缓冲液的控件滴定，可以从实验中逐点减去控件的积分峰值。这种对于小结合热的校正可能会导致比减去常量更嘈杂的结合等温线。
  • 要注意的是，控件滴定应在整个滴定过程中产生可重复的注入热量，并产生一条无或坡度很小的线性图（图1）。
  • 而不是逐点校正，您可以创建一条线，或获取控制滴定的平均注入热变化，然后从实验数据中减去它。
  • 如果实验结合曲线的最后几次注入有非零坡度，和/或控件滴定是非线性或有大坡度，应考虑此类结果的可能原因以及是否可以充分校正。
  • 在通过这些方法中的一种校正稀释热后，饱和时的结合焓应趋于零，并可以使用适当的模型拟合结合等温线以确定结合参数。

图1：原始ITC数据，控件滴定（配体进入缓冲液）（红色），和结合实验（配体进入大分子）（黑色）。注意，控件滴定的峰与结合实验的最后几次注入在形状和大小上相似。

图1：标准化热量变化，控件滴定（红色）和结合实验（黑色）。数据与单一结合位点模型拟合。

在首次实验后优化ITC实验

  • 通过调整池样品和/或注射器样品的浓度可以改变结合等温线的形状和位置，从而优化数据的质量。您还可以更改注入量和注入次数。如果有初步数据，您可以使用“设计实验”向导的高级选项或其他ITC数据模拟工具来模拟结合等温线，并设计未来的实验。
  • 您可能无法使用“最佳”浓度进行结合：非常低的反应物浓度可能会导致实验信号过小（取决于结合焓ΔH），而非常高的浓度对于生物聚合物可能会不实际或无法实现（例如，如果蛋白质在高浓度时易聚集）。
  • 如果无法将配体浓度提高到在注射器体积内容物的注入后达到结合饱和的水平，您可以将大分子-配体复合物留在ITC池中，使用更多的配体填充注射器，并进行第二次滴定实验。这可以重复进行直到达到结合饱和为止。
    • 为了拟合数据，使用Concatenation软件工具组合两个（或多个）ITC数据文件
    • 下载 MicroCal ITC Concatenation 软件
  • 如果结合亲和力和大分子浓度使C值超出最佳范围会发生什么？对于结合非常紧密的反应（其中可能出现C > 1000的情况），只能从ITC实验中准确测定ΔH和N。其他方法，例如使用预结合弱结合配体的置换/竞争实验，可能仍然可以让用户确定KD。
  • 对于弱结合事件，可能仍然可以通过在“低C范围”内工作（C值低于1-5）获得有用的数据，通过使用非常高浓度的配体在滴定结束时驱动结合接近饱和。在这种情况下，结合等温线往往是非S型的，可能需要在拟合过程中固定N，只有结合亲和力可以有信心地测量。ΔH不会由实验很好地定义。然而，在N已知并可以在拟合过程中固定的情况下，如果必要，这样的实验仍然可以非常有启发性。您还可以进行设计用于表征弱结合物的置换/竞争实验。

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