DSC和蛋白质稳定性：焓变意味着什么？

差示扫描量热法（Differential Scanning Calorimetry，(DSC)）是唯一一种能够直接测量热跃迁焓变（∆H）的分析方法，例如蛋白质、核酸或其他生物聚合物的热变性。

什么是∆H？

∆H是指在恒定压力下将系统升温至温度T所吸收的总能量。对于蛋白质来说，这意味着展开蛋白质所消耗的能量（热量），∆H为正值，代表一个吸热过程。此能量与所有原子和分子运动及保持蛋白质处于折叠构象的化学键能相关。

通过积分热谱图下的面积（见下图）来计算∆H，并以每摩尔蛋白质的卡路里（或焦耳）表示。在DSC实验中，随着蛋白质暴露于不断升高的温度，蛋白质开始热变性，因非共价键被破坏。∆H与维持蛋白质处于天然（折叠）构象所需的键的数量有关。

∆H取决于我们测量蛋白质总浓度的准确性。如果蛋白质浓度未能准确测定，计算出的∆H值将受到影响。

∆H值在实际中告诉我们什么？

当您比较不同蛋白质的DSC结果时，∆H值较大的蛋白质不一定比∆H值较小的蛋白质更稳定。由于∆H是按蛋白质总摩尔浓度标准化的，该值通常与蛋白质的大小成比例。大多数蛋白质具有相同的键密度（单位体积的键数）。因此可以合理地推测，分子量较大的蛋白质也会有较大的∆H。

∆H取决于溶液中天然蛋白质的比例

一个重要的考虑因素是，DSC只能测量最初处于折叠（天然）构象的蛋白质的∆H值。∆H的大小取决于折叠部分的浓度。如果初始折叠蛋白质部分小于蛋白质总浓度的100%，则计算出的∆H值将相应较小。

下图展示了相同蛋白质在不同储存时间内测量的DSC热谱图。蓝色热谱图代表新制备的100%天然（折叠）蛋白质。随着蛋白样品储存期间的劣化，溶液中天然蛋白质的部分开始减少，导致DSC热谱图中的焓值下降。我们可以利用不同热谱图中的相对∆H值来估算每个样品的折叠蛋白质部分，条件是我们有一个参考的DSC热谱图，显示100%的天然蛋白质。

在这个例子中，绿色热谱图样品的∆H为蓝色样品∆H的50%，因此它是50%的折叠蛋白。橙色样品有25%的折叠蛋白，而红色样品有10%的折叠蛋白，相对于蓝色热谱图。

量热焓和范特霍夫焓

到目前为止，在这篇博文中，我们讨论的是由DSC直接测量的“量热”焓，通常表示为∆H_cal。从DSC数据中，我们还可以计算另一种焓值，即范特霍夫焓 – ∆H_vH。该值可以从DSC非双态模型拟合中得到。∆H_vH也是可以从任何非量热（间接）热溶解技术，如圆二色光谱中确定的焓。

通过DSC，∆H_cal仅由过渡峰下方的面积确定，而∆H_vH仅由过渡峰的形状确定。过渡越尖锐，∆H_vH越大，反之亦然。∆H_cal是浓度依赖的，但∆H_vH不是。

通常，若∆H_cal/∆H_vH的比值等于1，则认为所研究的过渡符合双态展机制。若∆H_cal/∆H_vH的比值大于1，表示有显著比例的中间体存在；而若比值小于1，则意味着分子间相互作用。

用∆H_cal/∆H_vH可以估计蛋白质中有很大比例是不活跃的。如果我们有一个简单的单结构域蛋白，并假设不存在中间体，可以期望其展开过程的∆H_cal/∆H_vH比值不太偏离1。因此，如果∆H_cal明显低于∆H_vH，可能表明蛋白质中有很大比例已经是不活跃的。

总结来说，通过DSC对∆H数据的分析，可以深入了解蛋白质的展开机制以及有多少蛋白质处于其天然构象中。

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