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动态光散射(DLS),有时称为光子相关光谱仪或准弹性光散射,是一种经典用于测量通常分散于液体中的亚微米区粒子的技术。某些现代系统的灵敏度如此之高,因此现在也可以用于测量溶液中大分子的大小。
在这个新的网络研讨会中,我总结了该技术的工作原理、其尺寸和浓度的限制,并讨论了其优点和缺点。
此次网络研讨会受到了良好反馈,我收到了一些问题,我想在下面的问答中列出其中一些。
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截距值是信号/背景比,值会根据样品和仪器光学配置而变化。合适的值介于10%到100%(即0.1到1.0)之间。低于预期的值可能表示样品浓度过高或过低,或样品的吸收或荧光。样品浓度过高可能导致多重散射效应,从而降低截距值。NIBS配置的Zetasizer Nano S/ZS/ZSP允许最大程度地减少激光束的路径长度,从而最小化任何存在的多重散射。如果存在低过剩散射,即分散剂和分散其中的颗粒之间的散射差异,则截距会较低。样品的荧光或吸收也会降低截距。在荧光的情况下,可以选择在仪器中安装窄带滤光片以去除任何存在的荧光光。
DLS通过测量散射光强度的随时间波动,因此从该技术获得的基本信息是基于散射光的强度。Z平均直径是从ISO22412(2017)定义的累积分析中获得的强度加权平均直径,主要尺寸分布基于强度。
虽然将测量的强度分布转换为体积或数量看似简单,但强烈警告DLS用户小心不要过度分析结果。DLS技术往往会高估分布中峰的宽度,并且在转换为体积和数量时这种效应会放大。体积和数量尺寸分布应仅用于估计单独峰中材料的相对量,因为均值,特别是宽度,较不可靠。因此,建议使用强度尺寸分布来报告分布中每种模式的尺寸,但使用体积或数量数据来报告样品中每种颗粒族群的相对量。
动态光散射测量的是散射光强度随时间的波动,这可以确定平移扩散系数(即布朗运动),从而得出颗粒/分子大小。
静态光散射测量的是散射光的时间平均强度。在Zetasizer产品系列中,散射光的时间平均强度被测量为样品浓度的函数(即分子溶液),从中可以确定大分子溶液的绝对分子量。在Mastersizer产品系列中,散射光的时间平均强度被测量为角度的函数,从而可以确定粒子的大小。
这个问题的答案是肯定的,可能会依赖。DLS假设测量的颗粒/分子正在进行随机布朗运动。这在稀释样品浓度下是成立的。然而,随着样品浓度的增加,可能会发生其他效应,如多重散射、受限扩散、颗粒-颗粒相互作用。虽然可以通过使用后向散射检测并在比色杯壁附近进行测量来最小化多重散射的影响,但受限扩散和颗粒-颗粒相互作用更难理解。通常,可以通过使用样品而非分散剂的粘度来补偿受限扩散。颗粒-颗粒相互作用更加复杂,无法补偿。
从DLS测量中获得的尺寸应该与样品浓度无关(ISO22412(2017))。然而,当获得的样本尺寸依赖于样品的浓度时,应进行稀释系列,并将每个样品浓度的测得扩散系数作为浓度的函数绘制,并将数据外推至零浓度。在零浓度下得到的值是真正的扩散系数(即平均尺寸)。这被称为动态Debye绘图,并在ISO22412(2017)中讨论。如果您的Zetasizer软件安装了高级蛋白特征密钥,则计算器中包含动态Debye绘图。
我附上了一些详细讨论浓度效应的文件。
动态光散射(DLS)在蛋白质治疗剂配方中的应用:原理、测量及分析 – 2. 浓度效应和颗粒相互作用
FAQ – 什么是多重散射?
FAQ – 什么是受限扩散?
动态光散射的尺寸下限取决于许多因素,例如仪器的光学配置、激光波长/功率、检测器灵敏度、样品浓度和过剩散射极限。后者是分散剂与分散其中的分子/颗粒之间的散射差异。过剩散射越大,测量越容易。在Zetasizer上测得的最小尺寸为0.6纳米(峰值模式),我附上了一份应用说明,详述了这种测量。
应用说明 ”使用动态光散射测量亚纳米尺寸“
这通常意味着您的样品含有非常大的颗粒/聚集体/灰尘,这干扰了测量。我们称之为数量波动,我附上了一份FAQ,其中有更详细的讨论。可以确定的是该样品不适合DLS,必须在测量前移除大材料。
FAQ – 什么是数量波动?
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