利用二次谐波发生生物传感器发现动态蛋白质中诱导构象效应的片段

用于识别与蛋白质相互作用的配体的化合物库的生物物理筛选是有效的，但通常不能揭示配体是否（或如何）干扰其功能特性。为此，需要进行生化/功能分析。但是对于功能依赖构象变化的蛋白质来说，这种分析通常较为复杂或者通量较低。 

在这里，我们开发了一种高通量二次谐波发生 (SHG) 生物传感器，用于实时检测与蛋白质结合时诱导构象变化的片段，并识别动态区域。开发了多孔板形式的 SHG 分析，用于野生型和六种工程化改造的乙酰胆碱结合蛋白 (AChBP) 的单半胱氨酸突变体，乙酰胆碱结合蛋白是配体门控离子通道 (LGIC) 的同源物。它们通过胺或马来酰亚胺偶联与二次谐波活性标记结合。 

为了验证该分析，证实了烟碱乙酰胆碱受体 (nAChR) 激动剂和拮抗剂在 AChBP 中诱导的构象变化在性质上是不同的。随后筛选了一个 1056 片段文库，并成功地确定了 AChBP 的构象调节剂，命中率为 9%-22%，取决于 AChBP 的变异体。选取四个 hit 子集进行正交验证和结构分析。基于时间分辨格栅耦合干涉测量的生物传感器分析证实了相互作用为可逆的 1-步骤 1：1 相互作用，并估算了亲和力与相互作用动力学速率常数 (KD = 0.28–63 μM, ka = 0.1–6 μM−1 s−1, kd = 1 s−1)。其中两个片段的 X 射线晶体学证实了它们在先前描述的构象动态位点上的结合，对应于 LGIC 的调节位点。 

这些结果表明，SHG 具有识别诱导蛋白质构象变化的片段的敏感性。具有不同于已知 LGIC 调节因子的反应谱的片段命中的选择被表征并被证实与蛋白质的动态区域结合。