候选治疗性蛋白质的稳定性对其研发的成功或失败至关重要。 蛋白质的稳定性影响其生产、制造、制剂、长期储存、传递给患者和疗效。 高稳定性蛋白质倾向于在生产过程中遇到的问题更少、生产成本更低、效益更大，并在制剂和储存过程中更有机会保持功能。 在生物制药开发的“质量源于设计”(QbD) 方法中，稳定性表征是候选分子的“开发可行性”和“成药性”初步评估的一部分，并在流程研发和生产过程中经常重提。 稳定性数据还整合到用于生产支持、生物制药可比性和生物相似性的高级结构 (HOS) 表征和“指纹图谱”中。 对于新生物制药和生物相似性，蛋白质 HOS 表征正在成为注册申报中的纳入标准。
由于蛋白质的复杂性，生物物理表征工具在生物制药产品的分析中非常重要。 现在，有多种生物物理工具常用于蛋白质稳定性的评价，包括但不限于：圆二色光谱 (CD)、动态和静态光散射法 (DLS 和 SLS)、尺寸排阻色谱-多角度光散射 (SEC-MALS)、傅里叶变换红外光谱 (FTIR)、分析性超滤 (AUC)、尺寸排阻色谱法 (SEC)、差示扫描荧光 (DSF)、内源荧光 (IF) 和差示扫描量热法 (DSC)。
虽然所有这些技术在生物制药研发中都具有非常重要的作用，但通过 DSC 表征热稳定性是最关键的。 在一篇 2015 年有关用于单克隆抗体高级结构表征的生物物理技术文章中，Gokarn 等 表明：“DSC 仍是在给定缓冲液条件下评价蛋白质热力学稳定性的无与伦比的技术”[1]。
本白皮书着重描述使用 DSC 表征在预制剂和制剂研发过程中蛋白质生物制药（主要是抗体）的热稳定性，目的是选择蛋白质优先处于其自然、折叠构象的溶液条件，以生产稳定有效的药品。
DSC 是用于表征蛋白质、核酸、脂类和其他生物聚合物的热稳定性和构象稳定性的微量热法 [2-7]。 DSC 测量作为温度函数的热容。 在本白皮书中描述的用于蛋白质表征的 DSC 仪器是“功率补偿”仪器，具有固定到位的、缓冲液中包含生物聚合物的样本池，以及匹配的、注入相同缓冲液的参比池。 来自样本池的热容 (Cp) 信号与来自参比池的信号进行比较。 随着两个池中的温度升高，参比池和样本池之间的温度差将会持续测量并校准为功率单位。 已知 DSC 是一种“强制降解试验，随着蛋白质暴露到不断升高的温度中，蛋白质开始去折叠，且蛋白质的 Cp 相应升高（图 1）。
图 1：DSC 的工作原理：热容 (Cp) 随蛋白质热变性变化。 DSC 实验开始时的温度下，蛋白质主要处于其自然构象中折叠的状态。 随着温度升高，在某些点蛋白质将开始去折叠/变性 (Tonset)（热分解起始温度）且 Cp 升高。 在 50% 的蛋白质处于自然构象而 50% 已变性的温度下，Cp 将达到其最大值 - 这就是热转变中点或 TM。 高于 TM，蛋白质将主要发生变性，且在 DSC 实验结束时，所有蛋白质都将处于去折叠构象。 用于 DSC 的实验参数包括 Tonset、TM 和去折叠焓 (ΔH)。
DSC 直接测量热容改变、不需要荧光或任何其他标签或探针。 对于可逆变性的蛋白质，热转变中点 (TM)，也称为熔化或变性温度，是蛋白质处于构象平衡的温度。其中 50% 处于自然（折叠）构象，而 50% 处于变性构象。 TM 被看作 DSC 热谱图的“峰”。
TM 被认为是热稳定性的良好的表示 – TM越高，蛋白质的热稳定性越好。 多结构域蛋白质（如抗体）通常在 DSC 热谱图上生成多个峰，因此可确定多个 TM（示例见图 2）。
图 2：单克隆抗体的代表性 DSC 热谱图，已确认 CH2、Fab 和 CH3 结构域。 红色虚线为每个结构域转变的去卷积峰，标名三个 TM。
DSC 提供其他有用参数，这些参数可用于表征和排序蛋白质稳定性，包括由曲线下面积测量得出的去折叠焓 (ΔH)。 蛋白质去折叠是一个吸热过程，这是由于正确保持蛋白质折叠的二级非共价键断裂需要吸收热量。 DSC 还确定 Tonset （去折叠起始）、ΔCp （去折叠的热容改变）、T1/2 （1/2 峰高度处的宽度，表示去折叠热谱图的形状）。 DSC 分析可包括确定这些参数的任何组合。
大多数蛋白质变性不可逆，并倾向于在加热时聚集或沉淀。 TM 和其他来自变性不可逆性蛋白质 DSC 分析的参数不是真正的热力学参数。 但是，来自变性不可逆性蛋白质 DSC 分析的 TM 排序对于稳定性筛选是非常有用的定性参数。
马尔文仪器提供 MicroCal VP-Capillary DSC 系统 [8,9]，设计用于 TM 筛选和热力学表征溶液中蛋白质和生物聚合物的自动化差示扫描量热仪。
图 3. 生物制药发现和研发流程的总体方案。
图 3 显示生物制药发现和研发流程的总体方案。 绿色部分强调生物物理表征（包括稳定性实验）最常用的点，（除此以外，在本白皮书结束部分为有关生物制药发现和研发的“补充阅读资料”列表）。
形成多肽链的氨基酸序列称为蛋白质的一级 (1°) 结构。 除此以外，还有另外 3 个水平的高级结构 (HOS)，这些高级结构对于以完全了解蛋白质的稳定性、功能性、活性和总体性质为目的的表征非常重要。 蛋白质二级 (2°) 结构是指蛋白质初级结构的局部折叠方式，包括 α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲；三级 (3°) 结构是指由大量二级结构元素构成的最终三维构象；最后，四级 (4°) 结构说明两条或更多相同或不同的多肽链相互作用的结果。
生物治疗药物最常见的给药方式是通过皮下 (SC) 注射。 SC 传递的蛋白质药物在非常高的蛋白质浓度时（超过 100 mg/mL）在其密封容器（如小瓶或载药注射器）内必须稳定并不受影响，时间通常为几年。 考虑到这一点，为了创造所需生物制药，科学家在候选分子选择过程中最初寻找已显示出高稳定性的生物分子；但是，在整个研发和生产过程中有很多可影响分子稳定性的因素，这意味着可能需要通过蛋白质工程来提高稳定性。
纯化过程涉及从蛋白质稳定、正确折叠和有活性的条件中去除蛋白质，因此小心修改缓冲液、助剂、纯化方法和储存条件，以尽可能在这时保持蛋白质稳定。 如热、化学品、pH 改变、压力、混合和高浓度等的应激源在整个生物制药制剂和生产过程中频繁发生，当蛋白质分子暴露在这些应激源下时，其构象会偏向变性（去折叠）形式。
溶液中的蛋白质还对如脱酰胺作用和氧化作用的修饰敏感，这类作用可导致变性、无活性蛋白质。 就蛋白质生物制药而言，变性或其他修饰可导致聚集形成，进而导致产品疗效降低或成为无效药品。 可能更为重要的是，越来越多的证据指向蛋白质聚集可能在患者体内造成不利的和可能致命的免疫反应中发挥作用。 使用固有稳定蛋白质可使生产成本更低效益更大，并带来成功的、有效安全的药品。
DSC 提供构象稳定性和三级、四级结构改变（当蛋白质热变性时发生）的详细概览，以及有关内在和外在因素如何影响蛋白质稳定性的信息。 DSC 被认为是生物制药蛋白质热稳定性表征的最佳试验和定量最好试验，并常用作长期稳定性的预测指标[1,10-14]。 使用 DSC 生成的 TM 是在候选分子选择、制剂筛选和流程研发过程中频繁用于稳定性排序的参数；来自 DSC 的焓 (ΔH)、Tonset、T1/2 和 ΔCp也用于稳定性排序、验证 DSC 数据、定量分析蛋白质去折叠、和“指纹识别”高级结构[10-14]。
用于定义溶液条件下高度相似蛋白质的 DSC 分析为可重复定量分析（图 4）。 即，DSC 热谱图将会由相似的轮廓，且参数（包括 TM、ΔH 和 Tonset）将会位于可接受范围内[12-14]。 如果显示的热谱图不同且 DSC 符合参数改变，这就表明已发生如蛋白质错误折叠、降解、聚集、缓冲液差异、转变后修饰改变或其他高级结构改变的事件，影响蛋白质的构象稳定性。
图 4：19 个 PBS 中牛血清白蛋白的 DSC 热谱图（Sigma A1933，色谱纯化）。 DSC 数据在扫描速率标准化、缓冲液-缓冲液减法以及集成和基线减法后显示。 显示 Tonset、TM1 和 TM2 的均值和标准差。
可重复和定量结果使得 DSC 成为在生产（包括批次间和工厂间可比性）、蛋白质变异体与修饰产物（包括由醣基化作用、脱酰胺作用和氧化作用造成的结构变化）比较、以及生物相似性比较过程中评价蛋白质的重要 HOS 表征工具。 DSC 数据还可在监管支持文档作为新药物和生物相似性申报的 HOS 表征中使用。 在一项生物制药科学家的调查中，DSC 排列为对于在候选药物选择、制剂研发、产品表征、可比性和生物相似性中“及其有用”的生物物理分析技术非常有用[15]。
TM 值可从 DSC 热谱图峰非常简单的确定，不需要复杂的数据分析。 如我们前面所示（图 2），对于如抗体的多结构域蛋白质，DSC 热谱图显示多个去折叠转变。 DSC 可表征和定量不同结构域，并可为两个或多个转变确定 TM。 可确定 TM 的其他生物物理试验，如 CD、IF 和 DSF 仅可检测第一个 TM （产生于最低温度时），或多结构域蛋白质最“主要” TM 。 从光谱或荧光数据提取多个 TM 需要复杂的数据拟合，且可能不能重复。
与其他 TM 筛选试验比较，DSC 通常每次扫描需要更多蛋白质样本，且通量更低。 如果样本有限，一个选择是使用 DSF 或 IF 执行 TM 排序，随后选择几个关键样本以使用 DSC 验证 TM。 执行该 DSC 验证步骤非常重要，且不能依赖于单独的荧光或光谱来测量稳定性试验中的 TM。 基于荧光的试验通常会遇到干扰测量的伪影，偏移的 TM 导致值偏高（偏低）。 此外，某些蛋白质和缓冲液条件与荧光不兼容，使 DSF 和 IF 均不适用。 最后，荧光和光谱无法确定量热焓和其他由 DSC 提供的热力学参数。
研究人员认为 DSC 是生物制药行业中热稳定性试验的金标准，原因是其拥有如下技术：
测量与蛋白质去折叠相关的热改变
直接测量蛋白质去折叠，因此无需标签、探针或标记（因此，DSC 不会检测到在荧光或其他光谱试验中常见的潜在伪影）
适用于溶液中的自然状态蛋白质
可用于常用于生物制药纯化和制剂的几乎所有缓冲液和助剂 与此相反，许多这些缓冲液和助剂与荧光和光谱不兼容
易于设置和操作
温度控制高度精确，操作范围高至 130 °C，因此可检测大多数高 TM 转变。 大多数其他 TM 筛选试验仅可加热样本至 100 °C （或更低）
是一种“强制降解“试验，不需要在分析前在加热的缓冲液中储存的蛋白质
拥有简单数据输出和集成式数据分析软件
可用于解决单独的去折叠转变和表征多结构域蛋白质和蛋白质复合物、以及简单的单结构域蛋白质
所含信息丰富，并提供出除构象稳定性和 TM 确定以外的热动力学数据
可用作生物制药热稳定性表征的首要试验；还可与其他正交/互补生物物理筛选工具配合使用，和/或验证其他数据
可用于热稳定性快速筛选的高通量自动化分析（MicroCal VP-Capillary DSC 系统）
随着基于蛋白质的药物从流程的发现向研发过渡，研发适当的、有效的、优化制剂（在运输、使用和整个预计有效期限内保持其稳定性、构象和疗效）非常重要。 制剂的生产必须成本低效益高。 首选可自己给药的蛋白质制剂以方便患者，这需要药品在无需医护人员帮助的载药注射器或类似传递系统中运输和储存；此外，药品必须在室温或冰箱中储存。 某些生物制药还可冻干运输（冷冻乾燥），这需要在给药前溶解药物。
在研发周期的早期，可用于测试的样本量常常有限，因此一些公司实施制剂研发，包括最初的小型生物物理研究以定义最佳缓冲液成分和 pH 以帮助稳定蛋白质。 这项工作帮助建立最终将使得蛋白质药物进入临床前和临床试验的制剂。 由于相同生物物理测试中的很多都包括在两组评价中，可在候选药物开发可行性评价的候选分子选择的同时进行制剂研发。
在蛋白质药物的预制剂和后续制剂研发过程中，蛋白质暴露在不同条件下，包括：
不同缓冲液、pH 值和盐浓度
不同制剂助剂（辅料） 辅料为在液体和冻干制剂中存在的惰性材料，以帮助稳定蛋白质或在生产或药物传递中提供帮助。辅料常用于生物制药产品，包括表面活性剂（如聚山梨醇酯-80）、糖类（如海藻糖）、多元醇（如甘油）、氨基酸、防腐剂和抗氧化剂在内
高蛋白质浓度，测量候选药物在发生蛋白质聚集之前可浓缩的水平（在一系列缓冲液和助剂中）
温度、压力和湿度的极限
反复冻融循环和搅动（如存在空气/液体界面、转运压力）
与一系列不同材料表面接触，包括最终密封容器的示例（如小瓶、载药注射器、静脉输液包）
不同水平的光
氧化剂
实时储存测试（通过在整个典型的两年有效期期间在预期储存条件下保存以评价长期稳定性潜力）和在升高温度的条件下的加速压力研究
2016 年一篇由 Kang 等[16] 发表的文章评价了已在商业多克隆抗体中成功使用的 37 种制剂。 评价摘要如下：
12 种冻干制剂和 25 种液体制剂（浓度范围为 2 mg/mL 到 200 mg/mL）
辅料包括：盐类、表面活性剂、多元醇、二糖类、多糖类、氨基酸和抗氧化剂
醋酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐和 Tris 缓冲液常用于维持最佳 pH 在 4.7 和 7.4 之间
大多数制剂使用三种常见表面活性剂之一：聚山梨醇酯 80（吐温 80）、聚山梨醇酯 20（吐温 20）和泊洛沙姆 188
所有冻干制剂都含有糖类（多元醇/二糖类/多糖类），而 30% 的液体制剂含有糖类
通常使用 NaCl
甘氨酸和精氨酸是常用的氨基酸辅料
水溶液中的蛋白质处于天然（折叠）和变性（去折叠）构象之间的平衡状态。 疏水作用和氢键作用是蛋白质的主要稳定力，要去折叠和变性分子就必须克服这些作用。 构象熵会削弱这些稳定力，因而允许蛋白质去折叠。 在制剂研发中，主要目标是找到提供最大水平稳定的液体条件，进而使自然状态蛋白质的比例最高。 变性蛋白质更易对不可逆化学过程敏感，如蛋白质水解、氧化作用和脱酰胺作用，进而导致失活和聚集。
生物物理表征工具用于监测对制剂和储存条件应答的蛋白质构象、预测热稳定性和测量聚集构象。 在本白皮书前面部分讨论的很多生物物理工具都包含在预制剂和制剂研发工作流程中。 包括 DSC、DSF、DLS、SLS、CD 和 IF。 这些试验评价蛋白质构象稳定性（通过 TM 确定、 Tonset、DSC DSC 热谱图轮廓）、HOS、颗粒大小和聚集构象。
通过 DSC 的 TM 排序常用作制剂 pH、缓冲液和辅料的初始筛选。 通常，测量的 TM 越高，制剂中的蛋白质越稳定（有关蛋白质 pH 筛选过程中的 DSC 热图请参见图 5），且在存储过程中越不容易发生聚集构象（请参见下方的案例研究）。 DSC 与在生物制药制剂中使用的几乎所有的缓冲液和辅料兼容。 即使蛋白质的热转变本质上不可逆，DSC 也是排序缓冲液条件和辅料在整个制剂研发过程中对蛋白质稳定性作用的方便快捷方法。
图5. 胰凝乳蛋白酶原在不同 pH 值下的 DSC 热谱图，其中 TM 指示每个 pH。
MicroCal VP-Capillary DSC 系统被大量 CMO 和 CDMO 用于生物制药构象稳定性表征和制剂研发。 这些公司包括 Patheon[16]、Fujufilm Diosynth Biotechnologies[17] 和 KBI Biopharma[18]。
加速稳定性研究（或“压力研究”）是生物制剂筛选中的共同要素，且涉及在一系列不同蛋白质制剂中、在升高的温度下储存候选分子，以及使用 SEC、DSC 和 DLS 评价这些随时间变化对构象稳定性、大小、聚集和潜在的翻译后修饰的影响。
一旦候选生物制药沿研发流程进展并有足量的蛋白质可用，表征重点转变为涉及最终制剂和生产的过程，以及蛋白质浓度和传递设备的潜在影响。 还实施长期稳定性研究以证明所选制剂中的蛋白质药物具有所需有效期和稳定性。 好的制剂将至少维持两年的生物制药 HOS 特征。
虽然无法绝对保证热稳定性在储存过程中将始终与蛋白质的物理稳定性相关，但更高的 TM 确实通常指示去折叠蛋白质需要更大的能量。 当蛋白质的所有其他特性都类似时，更偏向于热稳定性更好的蛋白质制剂。
一篇 1998 年由 Remmele 等[19] 发表的文章使用 MicroCal DSC 表征了包含不同辅料的缓冲液中的重组人白介素-1 受体类型 1 (IL-1R)。 使用储存在 pH 3-9 的溶液中的 IL-1R 进行的加速稳定性研究（在 30°C 和 50°C 下）显示，pH 6 时蛋白质断裂和聚集最少（通过 SDS-PAGE）。 “对照”溶液（20 mM 柠檬酸钠，pH 6.0）中 IL-1R 的 DSC 热谱图显示第一个 TM 在 48°C 处，第二个 TM 在 65.5°C 处。 测试了 23 种不同辅料，包括糖类（甘露醇、乳糖、蔗糖和葡萄糖）、多元醇（聚乙二醇、甘油和乙醇）、表面活性剂（吐温 80、普朗尼克 F68）、盐类（NaCl 和 CaCl2）、以及氨基酸（赖氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸）。 第二个 TM 不受辅料影响，因此第一个热转变的温度用于稳定性排序。 该策略的目的是寻找可提高低温转变 TM 的辅料，这指示天然蛋白质稳定性有积极改变。 大多数检测辅料导致 TM 下移（指示 IL-1R 失去稳定性）或轻微上移。 形成最大 TM（指示构象稳定性提高）上移的助剂为 100 mM NaCl，将第一个 TM 从 48.1°C 移至 53.1 °C。 作者尝试将 NaCl 浓度从 100 mM 增 至 1500 mM，并继续观察到 TM 升高。 这些结果提示作者存在 NaCl 时 IL-1R 的额外热稳定性是由 NaCl 与蛋白质的直接作用以及很有可能由水结构中的改变一并导致的。 在存在 100 mM NaCl 时进行了进一步辅料分析。
在此相同的研究中，作者观察了防腐剂对 IL-1R 稳定性和聚集的影响。 防腐剂包含在多剂量制剂中。 使用苄醇、间甲酚和苯酚，DSC 热谱图显示所有这三种防腐剂使 IL-1R 失去稳定性，其中苯酚对热稳定性的影响最小，而苄醇对 TM 有最大的打破稳定性作用。 在 37°C 条件下储存 7 和 60 天后，这些结果经聚集构象的 SEC 分析验证 – 含有苯酚的样本显示出最低水平的聚集，而含有苄醇的样本显示出最高水平的聚集。
Remmele 和 Gombotz[20] 表明通过 DSC 测量得出的 TM 是 CD40L 聚集的良好指标。 通过 DSC 执行 pH 稳定性筛选，最大 TM 在 pH 6 和 pH 7.5 之间测得，这与显示出如由 SEC 测量（在 37°C 条件下储存 7 天后）得出的最低聚集构象比例的 pH 范围相关。
Remmele[11] 总结了使用来自 DSC 热谱图数据的其他研究来预测并排序多种制剂中蛋白质稳定性（如胰凝乳蛋白酶原和胃蛋白酶原）。 Remmele 还讨论了 DSC 与其他分析技术（SEC-HPLC、CD、AUC、DLS、MS）联合使用如何能深入了解不同制剂中生物制药的构象稳定性，随后便可使用这些信息以做出选择哪种制剂继续研发的决定。
其他制剂筛选研究一致表明，通过加速稳定性研究和 SEC-HPLC 研究，TM 值高（由 DSC 测量）的制剂倾向于显示出更低的聚集水平[21-25]。
Burton 等[26] 评价了 DSC 作为快速筛选工具来评价两种模式重组抗体稳定性的应用情况。 监测了 TM 变化作为 pH 和/或辅料的功能，且结果与来自由 SEC 分析的样本的加速稳定性数据进行了比较。 MicroCal DSC 生成的数据与来自 SEC 的数据相关（DSC 测量的 TM 值较高的样本，SEC 测量的聚集水平也最低），因此，DSC 可确定最佳溶液 pH 和辅料对溶液稳定性的作用。 由 DSC 预测的最大稳定性值的 pH 值为 pH 7.5（对于蛋白质 I ）和 pH 6（对于蛋白质 II） - 这些值与每种蛋白质的长期溶液稳定性研究的预测相当一致。 在此引用作者的文章结论，“这些研究的结果表明微量热法是快速筛选溶液中蛋白质稳定性的有用工具，尤其是在当大量样本通常十分有限时蛋白质表征和制剂研发的早期...这可在很大程度上节省原料药需求、以及花费在样本准备和复合物分析上的时间和精力。”[26]
马尔文应用指南强调 Dr. Katherine Bowers (Fujifilm Diosynth Biotechnologies) 如何在制剂研发中使用 DSC[27]。 抗体 X 置于 pH 3 到 pH 8 的一系列缓冲液中，且立即 (T=0) 以及储存后 1 周执行 DSC 分析（使用 MicroCal VP-Capillary DSC）。
图 6：X 抗体在预制剂缓冲液中的 TM 值范围。 样品使用 MicroCal VP-Capillary DSC 分析，T = 0。
图 7：X 抗体在 T = 0 时的 DSC 热谱图。 (A) 溶于 pH 为 3.0 的柠檬酸缓冲液。(B) 溶于 pH 为 6.0 的琥珀酸缓冲液。 显示每个的 TM 和 T½值。
图 6 显示抗体 X 在初始预制剂筛选中 T=0 的主 TM 峰，而图 7 显示抗体 X 在 pH 3 柠檬酸缓冲液和 pH 6 琥珀酸缓冲液中热谱图。 根据测量的 TM 值可知，抗体在 pH 5.0 到 pH 7.5 的缓冲液中稳定性最好（最大 TM）。 在 T = 0 时，其他检测方法（UV、尺寸排阻色谱法 [SEC]、光散射和 SDS-PAGE）显示的不同缓冲液条件间的分辨率都均低于 DSC（数据未在此处显示）。
图 8：X 抗体在预制剂缓冲液中主转变 TM 值对应的 T½ 值范围，T = 0 和 T = 1 周。
如图 8 所示，T½ 值用于进一步比较不同制剂的条件。 T½ 是指在 DSC 热分析图中主转变最大高度一半时的峰宽度，反映了热转变的协同性。 T½ 值越低表示蛋白结构越紧密，因而更益于配成制剂。 本实验中储存一周后的最低的 T½ 值见于 pH 为 5.5 到 6.5 之间的缓冲液（图 8）。 所得数据可为后来的辅料筛选选取合适的缓冲液及 pH 梯度，从而显著减少不必要的费时的条件探索。 本研究表明 DSC 可用于在预制剂研发过程中快速进行 pH 及缓冲液条件优化。
还在不同缓冲液和辅料中表征生物制药产品以了解潜在蛋白质降解通路。 此信息帮助研发最终制剂。 通常，生物制药药物在制剂研发过程中储存于冰箱时不会降解，因此通常会进行温度压力加速稳定性研究，如前面几个示例中所述。 由 Zheng 等[28] 进行的研究检测了 IgG1 治疗性单克隆抗体 mAb-A 的降解。 这个团队使用 MicroCal VP-Capillary DSC 第一次评价了不同缓冲液（磷酸钠、柠檬酸钠和醋酸钠），不同的 NaCl 浓度（20 mM 和 100 mM），以及不同的 pH 值（pH 4.5、5.5、6.5 和 7.5）中的 mAb-A。 基于最大 TM 和 Tonset 值，选择了每个缓冲液组的最佳候选制剂以进一步评价：磷酸钠 pH 6.5 加 20 mM NaCl、柠檬酸钠 pH 6.5 加 20 mM NaCl、以及醋三钠 pH 6.5 加 20 mM NaCl。 这三种缓冲液中的 mAb-A 显示出相似的 TM 和 Tonset，以及几乎相同的 DSC 热谱图。 作为对照，该研究还检测了醋酸钠 pH 4.5 加 20 mM NaCl 制剂，其热转变和 TM 更低。
作者将四种制剂中的 mAb-A 储存于 40°C，并通过 SEC （将降解产物从自然状态蛋白质分离）、DLS（确定修改的第二维里系数以表征蛋白质间的相互作用）、LC-MS（测序降解产物）、疏水作用色谱法（将降解产物从自然状态蛋白质分离）、以及 SDS-PAGE（确定降解产物的分子量）进一步表征了蛋白质。 结果表明，与储存在 pH 6.5 的相同缓冲液相比，储存在 pH 4.5 缓冲液中导致了更多断裂。 此外，储存于 pH 4.5 诱导了 CH2 结构域去折叠，增大了 mAb-A 的表面可接触性，进而促进断裂发生。 虽然 DSC 显示 mAb-A 在磷酸盐 pH 6.5、柠檬酸盐 pH 6.5 和醋酸盐 pH 6.5 缓冲液中的构象结构类似，但 DLS 显示蛋白质间相互租用的效价在每种缓冲液中不同。 总之，该研究的结果表明蛋白质间相互作用在控制 mAb-A 聚集构象中有重要作用。 作者还表明，从该研究获得的知识对于 mAb-A 构象研发非常有用，但不应外推至其他 mAb。
纯化和储存过程中生物制药的蛋白质水解也是一个问题。 宿主细胞蛋白酶可能影响重组蛋白质的质量，并可导致显著产品损失。 相较于折叠蛋白质，去折叠或部分折叠蛋白质更易水解，且折叠蛋白质可通过添加渗透调节物质加以稳定对抗水解。
一项由 Mueller 等[29] 进行的研究中，对保护免疫球蛋白 M (IgM) 防止水解的机制进行了研究。 IgM 为新兴治疗性候选分子，但是其本质上不稳定。 在该研究中，将胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶添加到纯化 IgM、mAb 85，并在没有和存在辅料的条件下分析了降解情况。 由添加辅料甘氨酸和山梨糖醇造成的 mAb 85 构象稳定性增加通过使用 MicroCal VP-Capillary DSC 得到了验证。 mAb 85 在 2–3 热转变中去折叠取决于缓冲液的 pH，这些转变对应不同的结构域和结构区域。 通过在 pH 5.5 和 pH 7.4 条件下添加 20% 山梨糖醇或 1 M 甘氨酸（增加 4–5°C）或两者（增加 7–11°C），TM显著增大。 这就提出了山梨糖醇和甘氨酸的保护作用如何发生的问题。 一种可能性为这些辅料可能通过压缩其标准构象抑制了蛋白酶。 另一种可能性为 IgM 压缩，使得其不易被蛋白酶切。
为阐明机制，测试了低分子量底物的蛋白酶切。 这些底物通过优先排阻机制压缩其构象无法稳定。 木瓜蛋白酶的活性略微增加，而胰凝乳蛋白酶的活性基本没有变化，表明辅料可在不降低其活性的同时稳定木瓜蛋白酶。 这些结果指示辅料的保护性仅通过 mAb 85 的构象稳定性调控，这可能包括增加的压缩和可能降低的蛋白酶切位点可及性。 因此，在纯化和制剂过程中添加辅料（如山梨糖醇和甘氨酸）到缓冲液中可帮助减少或甚至消除生物制药制剂中对蛋白酶抑制剂的需要。
DSC 和其他生物物理学方法如何用于特定传递系统的专用制剂研发的示例在一篇 Morar-Mitrica 等的文章中描述 [30]。 Otelixizumab 是直接作用于人 CD3 的人源化 mAb (IgG1)。 由于临床剂量低（每剂 0.1 mg 到 0.5 mg），药品的研发浓度为 0.2 mg/mL。 给药时需要在含有生理盐水的静脉输液袋中溶解 mAb，随后通过输液泵传递整袋液体。 这导致蛋白质在静脉输液袋中的浓度低至 0.002 mg/mL。 由于低蛋白质浓度，存在通过与静脉输液袋和/或输液泵系统接触造成的显著蛋白质损失的高风险。 通过传统生物物理制剂研发和药物使用时稳定性研究，研发了吸附损失降低和氧化降解减少，且液体制剂在冷藏条件下稳定的药品。
对于标准制剂筛选，在存在或没有 0.1% 聚山梨醇酯 80 (PS80) 的条件下，otelixizumab 的 TM 值从 DSC 热谱图决定。 蛋白质的热谱图在存在或没有 PS80 的情况下类似，具有一致的去折叠曲线，表明没有作为表面活性剂功能的 HOS 改变。 至少与 2 个去折叠转变对应的两个团簇/结构域被 DSC 清楚识别。 mAb 在没有和存在 PS80 的情况下的 DSC 结果在 TM1 和 TM2 中没有显示出显著差异。 此外，如通过 DSC 计算得出的其他相关热力学参数（如 T1/2 和去折叠的总焓）的比较所指示，PS80 对 mAb 的热稳定性没有影响。
过氧化物可在原材料（如聚山梨醇酯）中大量存在，导致对生物制药产品的潜在氧化损伤，并造成如疗效降低的结果，以及可能造成不利免疫反应。 要评价氧化作用作为重要降解通路的风险，仅组氨酸缓冲液（含有 PS80）中的 otelixizumab 通过过氧化氢处理被氧化，且通过 DSC 评价氧化诱导的结构改变并与非氧化对照比较。 TM 分析显示氧化诱导的第一个去折叠转变失去稳定性，通常分配给 mAb 的 CH2 结构域。 TM1（低温转变）显著下降，伴有峰变宽。 第二个转变 (TM2) 不受氧化作用影响。 质谱法 (MS) 分析确认 CH2 结构域中的一个暴露的蛋氨酸残基的 90% 被过氧化物氧化。 这些结果表明，主要氧化位点是 CH2 结构域中的蛋氨酸残基，且氧化事件与该结构域的热力学失稳相关。 作者总结得出，给予低浓度治疗性 mAb 会面临挑战，且在研发早期实施制剂研发和药物使用时稳定性研究至关重要。
本白皮书中呈现的结果明确表示纳入 DSC 作为预制剂和制剂研发过程中的生物物理稳定性实验的重要性和有效性。 使用 DSC 结果以及其他稳定性实验，生物制药公司可明智选择最稳定的制剂，即蛋白质在其最终制剂中以及作为药品时不易出现长期稳定性和聚集问题。 这会转化为生产成本更低效益更大的药物生产，最终药物制剂更易保持活性、稳定、安全，并处于正确折叠的构象。
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