解锁洞察：使用 NanoSight Pro 掌握 细胞外囊泡荧光标记和分析

在本白皮书中，我们介绍了使用 NanoSight Pro 开发的细胞外囊泡 (EVs) 的荧光标记和检测方法，以及指导这些方法实施的代表性数据。我们使用来自尿液的 EVs，通过光散射和荧光分析评估其大小分布和浓度。采用多种荧光染料和荧光基团，我们不仅证实了 EVs 的存在，而且还有效地检测了其表面和内部 RNA 货物上的四次跨膜蛋白生物标志物。

1.0 简介

细胞外囊泡（EVs）因其不断发展的应用和突破而引起了人们越来越大的探索兴趣，特别是在疾病诊断和治疗潜力领域[1]。这些由活生物体内的细胞产生的微观生物物质最初被认为是细胞废物。然而，研究揭示了它们在细胞间通讯中的关键作用。细胞外囊泡是一个通用术语， 其亚型有许多定义，包括根据尺寸范围进行分类：小 EVs（<200 nm）和大 EVs（>200 nm）。外泌体是小 EVs的一种亚型，与源自质膜的 EVs 相关[2]。从体液中提取的细胞外囊泡伴随着非 EVs 成分，形成了一个相当多样化和异质的系统，这对分析表征提出了重大挑战 [2]。重要的EVs 表征包括尺寸和尺寸分布，这可以提供有关其来源和纯化方法有效性的信息。释放的 EVs浓度的变化可以表明细胞通讯的增加，使其具有诊断潜力 [5]。准确表征 EV s制剂的大小、异质性和浓度可为分析、了解生物功能和诊断提供重要信息。EVs 含有多种分子，如蛋白质、脂质和核酸（包括 RNA 和 DNA）。 EVs 的组成，包括其货物分子，可以反映其来源细胞的生理或病理状态。这一特性使得 EVs 成为一系列疾病的生物标志物，从癌症到神经退行性疾病和炎症性疾病[4]。迄今为止， 还没有公认的EVs 或 EVs 亚型的通用分子标记物 [2]。尽管在所有 EVs 中并不常见，但研究中广泛使用的值得注意的生物标志物是四次跨膜蛋白（包括 CD9、CD81 和 CD63），因为它们积聚在小EVs 的表面而不是细胞裂解物上 [5]。四次跨膜蛋白是完整的跨膜蛋白，复杂地参与细胞外囊泡生物学的各个方面，包括生物发生、货物分选以及与受体细胞的相互作用。由于它们在许多EVs 亚型表面的丰度很高，它们被认为是最容易用于研究的生物标志物，通常用于 EVs 分析并作为特定的外泌体标志物。因此，能够检测这些生物标志物在EVs研究中具有相当重要的意义[6]。此外，检测和量化 EVs 内部 RNA 的能力同样重要，因为它为了解 EVs 的诊断潜力和用于治疗的成功封装提供了宝贵的见解。分析EVs内部的 RNA 货物可以揭示其在细胞内通讯和疾病过程中的作用，同时也有助于标准化和质量控制[7]。

2.0 Nanosight NTA

由于 EVs 的复杂性，通常采用多种技术方法来全面表征 EVs，包括流式细胞术、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、质谱蛋白质组学、基于显微镜的方法和纳米颗粒跟踪分析 (NTA)[8]、[9]、[2]。 NTA 已成为快速表征细胞外囊泡高分辨率大小和浓度的常用技术 [10]。

图 1：NTA 光学装置示意图

NanoSight NTA 使用激光照射颗粒，并使用光学显微镜捕获颗粒的散射光。通过跟踪颗粒的布朗运动并应用斯托克斯-爱因斯坦方程， NanoSight 可以确定颗粒的流体动力学直径，通过颗粒计数确定浓度。 NanoSight Pro 具有额外的荧光功能，其中特定的激光激发使得发射的荧光波长通过匹配的长通滤光片到达检测器。此外，在测试之间激光会间歇性地停用并引入新鲜样品，以减轻光漂白的影响。这些新颖的功能与经过数据集训练的用于颗粒识别的神经网络相结合[11]，结合测试过程中连续可控的样品泵送，对于增强和确保荧光检测的质量至关重要。

荧光 NTA 可以帮助我们更深入地了解样品和区分亚群。这种能力对于 EVs 研究、评估纯化效率和确认外泌体样品中特定标记物或货物的存在变得越来越重要[12]。

3.0 材料和方法 

3.1 试剂

本研究使用来自 HansaBioMed Life Sciences 健康捐献者尿液的冻干外泌体形式的 EVs（货号 # HBM-PEU）。这些外泌体表达四次跨膜蛋白 CD9、CD63 和 CD81，先前已通过蛋白质印迹和流式细胞术证实[13]。外泌体通过膜、特异性生物标志物和 RNA进行标记。本研究提出了每种标记的最终方法。使用CellMaskTM 橙色质膜染色剂（Cat.# C10045，InvitrogenTM）和 ExoGlow TM -NTA 荧光标记试剂盒（Cat.# EXONTA200A1，System Biosciences）标记外泌体膜。通过直接标记抗体进行生物标志物检测，使用 Alexa Fluor® 488 和 PE/Cyanine7 荧光抗体来标记 CD9、CD63 和 CD81 四次跨膜蛋白。 Alexa FluorTM 488 抗人 CD9 单克隆抗体 (MEM-61)（Cat.# MA5-44126）和 Alexa Fluor TM 488 抗人CD81 单克隆抗体 (M38)（Cat.# MA5-44132）购自 InvitrogenTM。 Alexa Fluor® 488 抗人 CD63 抗体（Cat.# 353037）、PE/Cyanine7 抗人 CD9 抗体（Cat.# 312115）、PE/Cyanine7 抗人 CD63 抗体（Cat.# 353009）和 PE/Cyanine7 抗人CD81 (TAPA-1) 抗体（Cat.# 349511）染料购自 Biolegend。 Quant-iTTM RiboGreen RNA 试剂盒（Cat.# R11491，含有 RNA 试剂和 TE 缓冲液）购自 InvitrogenTM， 用于标记外泌体内的 RNA。

所有样品均在 pH 7.4 (1X) 的磷酸盐缓冲液 (PBS) （Cat. # 10010023，GibcoTM） 或去离子的无颗粒水 (Milli-Q) 中制备。

3.2 外泌体的准备

通过将 100 µL MilliQ 水添加到 100 µg 样品中，冻干的外泌体在去离子水 (Milli-Q) 中重构（图 2），并用移液器轻轻混合以生成浓度约为 1 × 1012颗粒/毫升的外泌体储液。

所有样品均使用相同的外泌体储液，在不同天进行制备和测量。由于所有样品的制备均采用体积稀释，因此引入稀释误差的可能性增加，从而导致报告的样品浓度值的变化。

图 2：尿液来源外泌体的溶解示意图

3.2.1 对照外泌体

使用过滤的磷酸盐缓冲液（PBS，1X）连续稀释，将外泌体储液按体积稀释 5000 倍，最终浓度约为 2 – 5 × 10⁸颗粒/毫升，这是 NTA 测量的合适浓度（图3）。这种浓度变化是由于采用体积法进行稀释，且是在不同的日子进行的。未标记的对照是在与各自标记的样品相同的条件下、且同一天和同一时间制备的。

图 3：示意图显示尿液来源外泌体的体积三步连续稀释至适合 NanoSight Pro 测量的浓度，用作非荧光对照

3.2.2 膜标记 

EVs结构中含有脂质双分子层，是利用膜染料标记其脂质膜的绝佳候选者。EVs 的膜标记相对简单，并且染色 EVs 发出的荧光信号通常非常有效，因为染料很容易渗透并大量融入脂质双层中[14]。由于染料对其他血浆成分或非 EVs 脂质成分敏感， 膜标记并不具有特异性，但它通常被用作纯化样品的第一步，以确认富集制剂中是否存在 EVs。使用 CellMaskTMOrange (CMO) 和ExoGlowTM，两种标记方案如下所示。

3.2.2.1 使用 CellMask™ Orange (CMO) 进行膜标记

使用系列稀释法将 CellMaskTM Orange (CMO) 血浆膜染色剂在 PBS 中稀释 10,000 倍，形成浓度为 5 µg/mL 的 CMO 染料储液（图4B）。将外泌体储液在 PBS 中稀释 10 倍，形成外泌体工作储液 A（图 4A）。将等体积 (10 µL) 的 CMO 染料储液和外泌体工作储液A 添加到微量离心管中，通过移液器轻轻混合，并在黑暗中室温反应 20 分钟（图 4C）。然后用 PBS 将外泌体-染料混合液进一步稀释 500 倍，达到适合 NTA 测量的最终外泌体浓度（图 4D）。

图 4：使用 CellMaskTM Orange (CMO) 标记尿液来源外泌体的步骤示意图。 A – 外泌体工作储液A的制备，B – CMO储液的制备，C – 标记混合液的制备及孵育，D – CMO 标记外泌体的最终稀释

3.2.2.2 使用 ExoGlow™ 进行膜标记

将ExoGlowTM-NTA 荧光标记染料在 PBS 中稀释 10 倍得到 ExoGlowTM染料储液（图 5B）。将外泌体储液在 PBS 中稀释 5倍，得到外泌体工作储液 B（图 5A）。将等体积（10 µL）的 ExoGlowTM染料储液和外泌体工作储液 B 添加到微量离心管中，通过移液器轻轻混合，并在黑暗中室温反应 20 分钟（图 5C）。然后用 PBS 将外泌体-染料混合液进一步稀释 1000 倍， 达到适合NTA 测量的最终外泌体浓度（图 5D）。

图 5：使用 ExoGlowTM 标记尿液来源外泌体的步骤示意图。 A – 外泌体工作储液B的制备，B – ExoGlowTM 储液的制备，C –标记混合液的制备及孵育，D – ExoGlowTM 标记外泌体的最终稀释

3.2.3 生物标志物-四次跨膜蛋白标记

CD9、CD63和CD81被用作外泌体标志物，因此, 检测这些四次跨膜蛋白的存在可以提供有关外泌体起源的信息。本研究中使用的外泌体含有制造商在产品说明书中确认的 CD9、CD63 和 CD81 标记物[15]。一抗标记用于标记外泌体表面的生物标志物。该方法使用与荧光基团耦合的抗体，从而能够直接识别并结合外泌体表面上的目标抗原。使用两种不同的荧光基团（Alexa Fluor® 488 和PE/Cyanine7），每种荧光基团与针对四次跨膜蛋白标记物的 3 种不同抗体连接：抗 CD9、抗 CD63 和抗 CD81。两种荧光基团的实验方案如下所示。

3.2.3.1 使用 Alexa Fluor® 488 抗体标记四次跨膜蛋白

抗人 CD9 Alexa Fluor® 488 抗体、抗人 CD63 Alexa Fluor® 488 抗体和抗人 CD81 Alexa Fluor® 488 抗体染料最初在 PBS 中稀释 50 倍，以产生三种荧光抗体储液（图 6B1， 6B2和6B3)。对于每种抗体染料储液，取 10 µL 添加到不同的微量离心管中。将等体积（10 µL）的外泌体工作储液 B（按照第 3.2.2.2 节中的方法制备）（图 6A）也添加到每个管中， 通过移液器轻轻混合，并在黑暗中室温反应 30 分钟（图 6C1、6C2 和 6C3）。然后用 PBS 将每种外泌体-抗体染料混合物进一步稀释500 倍，达到适合 NTA 测量的最终外泌体浓度（图 6D1、6D2 和 6D3）。

3.2.3.2 使用 PE/Cyanine7 抗体标记四次跨膜蛋白

PE/Cyanine 抗人 CD9 抗体、PE/Cyanine 抗人 CD63 抗体和 PE/Cyanine 抗人 CD81 抗体最初在 PBS 中稀释，以产生三种荧光抗体储液，分别稀释 10、10 和 40 倍（图 6B1、6B2 和 6B3）。对于每种抗体染料储液，取 10 µL 添加到不同的微量离心管中。将等体积（10 µL）的外泌体工作储液 B（按照第 3.2.2.2 节中的方法制备）（图 6A）也添加到每个管中， 通过移液器轻轻混合，并在黑暗中室温反应 30 分钟（图 6C1、6C2 和 6C3）。然后用 PBS 将每种外泌体-抗体染料混合液进一步稀释 500倍，达到适合 NTA 测量的最终外泌体浓度（图 6D1、6D2 和 6D3），如第 3.2.3.1 节所述。

图 6：用偶联荧光基团 (F*) 的一抗抗人 CD9、抗人 CD63 和抗人 CD81 抗体标记尿液来源外泌体的步骤示意图。 F*代表荧光基团。 A – 外泌体工作储液B的制备、B – F* 抗人（CD9、CD63 和 CD81）抗体储液的制备，C1-C3 – 标记混合液的制备及孵育，D1-D3 – F*抗人（CD9、CD63 和 CD81）抗体标记的外泌体的最终稀释。

3.2.3 RNA标记

外泌体通过其携带的货物（通常是以 RNA 的形式）介导细胞通讯。由于 RNA 被封装在外泌体内部，因此在不破坏外泌体的情况下表征该成分非常具有挑战性。在本文中，我们展示了 EVs 内部 RNA 标记的新方法。选择 Quant-iTTM RiboGreen 作为RNA 特异性染料，常用于溶液中的定量分析。在这里，我们利用该染料检测尿液来源外泌体中的 RNA。

3.2.3.1 使用 Quant-iTTM RiboGreen 标记 RNA

将 Quant-iTTM RiboGreen 在 20x TE 缓冲液（包含在标记试剂盒中）中稀释 25 倍，以产生染料储液（图 7B）。将外泌体储液在 PBS 中稀释 100 倍，得到外泌体工作储液 C（图 7A）。将等体积（20 µL）的染料储液和外泌体工作储液 C 添加到微量离心管中，通过移液器轻轻混合，并在黑暗中室温反应 30 分钟（图 7C）。然后用去离子水将外泌体-染料混合液进一步稀释50 倍，达到适合 NTA 测量的最终外泌体浓度（图 7D）。

图 7：使用 Quant-iT™ RiboGreen 标记外泌体 RNA 的步骤示意图。 A – 外泌体工作储液的制备 C、B – QuantiTTM RiboGreen 的制备，C – 标记混合液的制备及孵育，D – Quant-iT™ RiboGreen - RNA 标记的外泌体的最终稀释

3.3 纳米颗粒跟踪分析 (NTA)

纳米颗粒跟踪分析 (NTA) 的测量是在配备 488 nm 和 532 nm 激光器的 NanoSight Pro上进行，使用 NS Xplorer 软件（1.0版）。

根据染料激发和发射特性，对每次荧光测量应用适当的激光波长和荧光长通滤光片，如表 1 [16]、[17]、[18]、[19]、[20] 所示。PE/Cyanine7 具有非常宽的激发光谱，这意味着可以使用多个波长来诱导/触发荧光。选择 488 nm 激光用于 PE/Cyanine7标记的外泌体，因为该波长产生最强的 NTA 荧光信号。

表 1：荧光 NTA 测量所需的荧光染料和相应的激发波长以及长通滤光片

NS Xplorer 软件具有专属荧光模式，可在单次测量中对光散射和荧光进行组合分析，不仅报告尺寸分布，还直接报告浓度和荧光效率。通过比较单个实验中使用和不使用荧光滤光片测量的样品浓度，荧光效率提供样品中荧光颗粒的百分比。对于全面的荧光分析，光散射和荧光部分均采用默认设置，即 10 次捕获，每次捕获持续时间为 150 帧。光散射的测量使用自动相机调节和对焦设置，而荧光测量使用手动相机调节和对焦设置，且使用最高相机设置（曝光时间 = 40 ms，对比度增益 = 15.8）。所有样品均以约 5 µL/min 的流速进行测量。为了一致性和能够进行比较，所有对照样品均使用相同的荧光方法进行分析。在 NS Xplorer 中，使用经过机器学习训练的颗粒检测算法自动处理数据 [11]，无需用户输入，消除用户偏差从而生成更重复性的数据。

每种荧光标签都有数据呈现。原始尺寸分布的模式被记录为细胞外囊泡粒径参数（直径，nm）。浓度和荧光标记效率也通过NS Xplorer 软件测定。

4.0 结果与讨论 

4.1 对照外泌体

对照 EVs 分别使用 488 nm 和 532 nm 激光器以及相应的 500 nm 和 560 nm 长通滤光片进行测量。正如预期的那样，在光散射模式中成功分析了样品，并且使用激光器及相应的长通滤光片未检测到来自未标记 EVs 的荧光信号。

EVs 没有表现出自发荧光，也没有产生荧光分布，导致荧光效率为 0%。图 8 显示了外泌体的大小分布，代表了生物样品中通常的典型异质分布。

图 8：使用 488 nm 激光+500 nm 长通滤光片（橙色）和 532 nm 激光+ 560 nm 长通滤光片（蓝色）测量的对照尿液来源外泌体的光散射模式尺寸分布

分别使用 532 nm 和 488 nm 激光器测量的颗粒浓度为： 3.9 × 10⁸ 颗粒/毫升 和 4.5 × 10⁸ 颗粒/毫升 ，尺寸为 77.5 nm 和 82.5 nm。鉴于外泌体固有的异质性以及这些测量是在不同日期进行的事实，可以观察到其浓度的变化。然而，尺寸分布曲线在形状上始终保持相似。此外，由于样品是按体积稀释的，因此浓度会出现一定程度的变化也是预期的，并且落在该稀释方法的预期误差范围内。最佳做法是在标记样品的同一天进行对照NTA测量，以确认荧光基团的添加是否会影响样品的内在特性。

4.2 膜标记

由于通用 CMO 和 ExoGlow™ 染料很容易进入 EVs 膜中，因此可以在使用或不使用荧光滤光片的情况下测定总 EVs 浓度（Carnell-Morris 等人，2017 年 [14] [21]。两种染料均显示出约 100% 的高荧光效率，表明样品制备中的所有颗粒均被荧光标记（CMO 为 102%，ExoGlow™ 为 96%）。

CMO 和 ExoGlow™ 标记的光散射和荧光尺寸分布如图 9 所示。对于这两种染料，光散射和荧光尺寸分布具有相同的形状并重叠，表明整个样品尺寸分布范围已成功标记。标记外泌体的分布也非常符合对照 EVs 分布，表明标记过程没有影响外泌体的原始大小和浓度。

图 9：来自健康供体尿液的外泌体的光散射（蓝色）和荧光（橙色）大小分布，用 a) CMO 和 b) ExoGlow™ 膜染料标记。未标记的对照 EVs 尺寸分布以黑色显示。

膜标记 EVs 的尺寸和颗粒浓度数据如表 2 所示。两种染料之间报告的浓度和尺寸的差异更有可能是在不同日期进行的样品制备和测量的结果。使用每次捕获的浓度，对两个标记的外泌体样品的光散射和荧光浓度进行 t-检验。用 CMO 标记的外泌体的 p 值为 0.741，用Exoglow™ 标记的外泌体的 p 值为 0.288，这证实了 CMO 和 Exoglow™ 的光散射和荧光浓度在统计学上相同，置信水平为0.95。

尽管两种染料都能有效地对尿液外泌体进行染色，但它们的光稳定性却存在显著差异。当荧光基团暴露于高强度激光时，荧光过程可能会被中断甚至停止。光稳定性特性是特定于单个荧光基团的，并且可以反映荧光过程/信号可以持续多长时间。NS Xplorer 软件上的荧光衰减图用于评估染料的光稳定性。 CMO 染色的外泌体信号在荧光滤光片下比 ExoGlow™ 更明亮且更稳定，因为在捕获持续时间内 CMO 染色的外泌体每帧的颗粒保持不变（图 10a）。使用 ExoGlow™ 染色外泌体时， 荧光信号变得更暗，在衰减图中观察到急剧的衰减曲线，显示每帧的颗粒都在逐渐减少（图 10b)。然而，尽管标记的外泌体可见时间很短，但 NS Xplorer 软件成功地对其进行了跟踪、尺寸测定和计数。

对 EVs进行膜标记是一种简单、快速且有效的技术，通常用于验证纯化过程是否成功。然而，其缺乏选择性意味着共纯化的碎片也有可能被标记。因此，利用特异性抗体标记可以更可靠地确认 EVs 的存在。

图 10：NS Xplorer 软件的荧光衰减图显示了来自健康供体尿液的外泌体在 150 帧荧光视频的持续时间内每帧的平均颗粒如何变化，a) 使用 CMO 标记的光稳定特性和 b) 使用 ExoGlow 标记的光漂白特性

表 2：在 NanoSight Pro 上使用 CMO 和 ExoGlow 膜染料，以光散射和荧光模式测量健康供体尿液中外泌体的粒径（以 nm为单位）和浓度（以 particles/mL 为单位）

4.3 特异性标记

在 NanoSight Pro 上测量的每种 Alexa Fluor® 488 和 PE/Cy7 染料抗体的荧光浓度用于确认尿液来源外泌体中四次跨膜蛋白生物标志物的存在，并确定具有特定表面四次跨膜蛋白的外泌体的浓度。图 11 显示了用 NanoSight Pro 在光散射和荧光模式下测量的用抗 CD9、抗 CD63 和抗 CD81 抗体染料特异性标记的尿液来源外泌体的浓度。

表 3 显示了 Alexa Fluor® 488 和 PE/Cyanine7 外泌体的尺寸和颗粒浓度数据以及标记效率。经测量，用 PE/Cyanine7 标记的EVs 尺寸大于用 Alexa Fluor® 488 标记的 EVs 尺寸，这可能是因为 PE/Cyanine7 荧光基团（分子量 = 240 kDa，[18]）大于AlexaFluor® 488 荧光基团（分子量 = 800 Da，[16]）， PE/Cyanine7 标记的 EVs 可能具有更大的直径。然而，尺寸分布形状和范围仍然具有可比性。

图 11：使用 NanoSight Pro测量用 Alexa Fluro 488 和 PE/Cyanine7 抗 CD9、抗 CD63 和抗 CD81 抗体染料标记的外泌体的光散射和荧光测量模式的颗粒浓度。

表 3：使用 NanoSight Pro测量用 Alexa Fluor 488 和 PE/Cyanine7 抗CD9、CD63 和 CD81 抗体染料标记时，在光散射和荧光测量模式下的来自健康供体尿液的外泌体的粒径（以 nm 为单位）和浓度（以 particles/mL 为单位

荧光效率是比较每种荧光染料标记的四次跨膜蛋白浓度的有用参数。对于 CD9 标记，使用 Alexa488 和PE/Cyanine7 染料分别实现了 40% 和 35% 的荧光效率。对于 CD63 标记，实现了 46% 和 19%，对于 CD81 标记实现了 33% 和 10%。 Alexa Fluor®488 比 PE/Cyanine7 具有更高的荧光效率。这可能是由于 PE/Cyanine7 的空间位阻所致。由于荧光基团较大，它们可能无法与存在的所有四次跨膜蛋白结合，从而产生较低的荧光浓度，因此效率较低。 Oliveira-Rodríguez 等人在 2016 年的工作表明，健康捐献者尿液中的外泌体含有高浓度的 CD9 和 CD63，与本研究报告的标记效率一致[13]。

图 12 显示了使用 PE/Cyanine7 和 Alexa Fluor® 488 染料标记的 CD9、CD63 和 CD81 的尺寸分布。在所有情况下， 荧光尺寸分布的浓度都比光散射尺寸分布的浓度更低 - 这是预料之中的，并且反映在荧光效率上。

图 12：用 a) PE/Cyanine7 CD9、b) Alexa 488 CD9、c) Alexa 488 CD63 和 d) Alexa 488 CD81 抗体染料标记的尿液外泌体光散射（蓝色）和荧光（橙色）尺寸分布。

4.4 RNA标记

对于 RNA 标记，使用 Quant-iT™ RiboGreen 作为 RNA 染料实现了 54% 的效率，这意味着大约一半的外泌体可能含有RNA。测量的光散射浓度为 2.3 × 108 particles/mL，荧光浓度为 1.2 × 108 particles/mL，如表 4 所示。

表 4：用 Quant-iT™ RiboGreen 标记时，以光散射和荧光模式测量的健康供体尿液中外泌体的粒径（以 nm 为单位）和浓度（以 particles/mL 为单位）

尺寸分布如图 13 所示。光散射尺寸分布与对照尺寸分布重叠，表明标记没有影响 EVs 的尺寸分布和浓度。 NS Xplorer 软件的荧光衰减图显示了用 Quant-iT™ RiboGreen 标记的外泌体在 150 帧荧光视频的持续时间内每帧的平均颗粒如何变化（图 14）。

图 13：用 Quant-iT™ RiboGreen 标记的外泌体的光散射（蓝色）和荧光（橙色）尺寸分布。对照 EVs 的尺寸分布为黑色

如图 14 所示，Quant-iT™ RiboGreen 相对不稳定，因为每帧的粒子数量显著减少。

图 14：NS Xplorer 软件的荧光衰减图显示了用 Quant-iT™ RiboGreen 标记的外泌体在 150 帧荧光视频的持续时间内每帧的平均颗粒如何变化

5.0 结论

NanoSight Pro 已成为一种有价值的工具，越来越多地用于 EVs 表征，因为它能够跟踪单个颗粒的尺寸、尺寸分布和浓度测量， 并且其荧光模式有助于通过荧光标记检测外泌体。本白皮书阐述了如何使用 NanoSight Pro 探索各种标记方法，以揭示EVs 的不同特性。

使用荧光 NTA 检测 EVs 亚群是通过遵循一些简单的规则来实现的，这些规则涉及染料特性（例如光稳定性和亮度）、样品制备方法（例如抗体亲和力和特异性、孵育条件）和测量条件（例如样品呈现、仪器设置、测量时间）。首先，尿液来源细胞外囊泡（EVs）的尺寸、尺寸分布的异质性和浓度被有效地表征，作为对照测量。其次，使用两种具有不同光稳定性的荧光染料（CellMask™ Orange 和 ExoGlow™）证明了膜标记的成功。两种染料均表现出大约 100% 的标记效 率，证实了尿液来源 EVs 的存在和纯度，并展示了 NanoSight Pro 准确测量荧光信号的能力，甚至能够检测来自像Exoglow 等光漂白染料的荧光信号。

然后使用两种不同的染料 Alexa Fluor® 488（488 nm 激发波长）和 Pe/Cyanine（488 或 532 nm 激发波长）开发了生物标志物检测方法。两种染料都证实了 CD9、CD63 和 CD81 生物标记物的存在，由于两种染料之间的不同特性，Alexa Fluor® 488 有更高的荧光标记效率。最终，使用 Quant-iT™ RiboGreen 染料成功建立了 EVs 携带的货物的检测方法，RNA 标记效率达到 52%。

总而言之，正如广泛证明的那样，NanoSight Pro凭借其特殊的荧光模式，在推进细胞外囊泡 (EVs) 用于诊断和治疗的研究和开发工作方面拥有无限的能力。

6.0 参考文献   

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