展示与新型冠状病毒刺突 RBD 结合的候选 Sybody®

简介

与通常以单一化学实体存在的传统小分子药物产品不同，生物药物（如抗体、纳米抗体和其他在生命系统中制造的大分子）非常复杂。这使得它们的表征极具挑战性，特别是因为许多生物药物以多种变体形式存在，其性质和丰度受生产工艺的严重影响。在当前的新冠肺炎疫情中，合成单域抗体（也称为纳米抗体或 Sybody）可能是新冠肺炎预防性治疗发展的关键，因为它们适合以吸入纳米体制剂的形式进行肺部给药 ¹。

结合亲和力可以说是生物药物（如 Sybody 分子）得到最广泛研究的特性之一。但是，除非与药物的其他性质一起评估，否则结合亲和力不能提供足够的信息来预测临床疗效。生物药物研发中的全面表征同样应当包括通过精确测量抗体-靶标相互作用的结合和解离速率来实时分析结合动力学。

借助无堵塞微流控技术和对传统表面等离子体共振 (SPR) 技术的卓越灵敏度可以实现更精确地测量结合亲和力与结合动力学，我们在此展示了 Creoptix WAVE 如何通过深入了解 Sybody 候选物对新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域 (RBD) 区域的结合亲和力和选择性来推动生物药物的发展。

材料和方法

ACE2 结合动力学

生物素化的 RBD-vYFP 被捕获到链霉亲和素 PCP-STA WAVEchip（聚羧酸盐准平面表面；Creoptix AG）上，密度为 1000 pg/mm²。然后，在添加了 0.05% 吐温 20 的 TBS 缓冲液 (TBST) 中，以 6.25 nM 至 400 nM 的递增浓度进样 ACE2（系列稀释两倍，7 个浓度）。以每通道 15 μL/分钟的流速进样 ACE2，进样 360 秒，并将解离设置为 1200 秒以允许返回基线。在 25°C 下记录传感器图，并在 WaveControl 上分析数据。通过减去空白进样和参比通道的信号，对数据进行双重参比。采用 Langmuir 1:1 模型进行数据拟合（见图 1）。 

ACE2 竞争

单独进样选择的 Sybody（浓度 500 nM，TBST 中）、单独进样 ACE2（浓度 250 nM，TBST 中）或进样 Sybody (500 nM) 和 ACE2 (250 nM) 的混合物，进样 300 秒，将解离设置为 1200 秒以允许返回基线。在 25°C 下记录传感图，通过减去空白进样和参比通道的信号，在双重参比后使用 WAVEcontrol 叠加数据。 

图 1：纯化 ACE2 与生物素化刺突 RBD 的结合动力学

结果

研究历史

我们的合作始于收到 57 个表现良好且独特的候选 Sybody，这些均由 Linkster Therapeutics AG 和 Markus Seeger 教授（医学微生物研究所；苏黎世大学）使用 Sybody 平台创建 ²。因此，所有候选 Sybody 都要接受在 Creoptix WAVE 上接受解离率筛选，以鉴别出六种刺突 RBD 的强结合物。与 ELISA 数据一致，但提供了更多动力学的结合率和解离率，然后测定结合常数，揭示了 20-180 nM 范围内的亲和力 ³。考虑到其紧密结合特性，亲和力与 ACE2/刺突相互作用范围相同，我们决定进一步表征六种候选 Sybody，并研究它们竞争 ACE2 与刺突 RBD 结合的能力。

候选 Sybody 竞争 ACE2 与刺突 RBD 的结合。由于新型冠状病毒的毒力需要病毒刺突 RBD 与人 ACE2 结合，我们评估了选择的候选抗体在共同进样时抑制 ACE2 与刺突 RBD 结合的能力。 

链霉亲和素 PCP-STA WAVEchip 用于捕获生物素化的刺突 RBD，候选 Sybody 和纯化 ACE2 以指定浓度单独或组合进样。如图 2E 所示，在 Sybody 16 存在下，ACE2 与刺突 RBD 的结合几乎完全消失，表明对 ACE2 - 刺突相互作用的抑制水平非常高。在 Sybody 3 或 Sybody 42 存在时具有部分抑制作用（分别见图 2C 和 2D），而在 Sybody 67 中则完全没有抑制作用（图 2B）。此 GCI 数据与之前报告的 ELISA 结果一致（图 2E），其优点是能够更快地表征此抑制试验。使用这类分析试验收集的证据支持以下观察结果：候选 Sybody 3、16 和 42 可以识别刺突 RBD 上与 ACE2 结合位点重叠的表面区域。 

图 2：候选 Sybody 竞争 ACE2 与刺突 RBD 的结合

结论

简而言之，我们在此展示了 Creoptix WAVE 如何能够快速表征源自之前发布的候选 Sybody 库，此外还证实了对这些候选 Sybody 如何抑制 ACE2-刺突相互作用的见解 ³。Creoptix WAVE 提供了对 ELISA 数据的快速和正交验证，非常适合通过加速抗新型冠状病毒病疗法的研发，在理解新冠肺炎疫情的竞赛中保持领先。

关键要点

利用 Creoptix WAVE 了解治疗药物开发的结合动力学并生成新数据，以加强结果和出版物: 

• 快速而有洞察力的抑制分析 ：更快地表征结合并理解竞争动态。 
• 验证您的 ELISA 结果 ：可靠地关联竞争分析的数据。

非常适合：

• 吸入制剂的研发
• 表位作图
• ELISA 数据的正交验证

致谢

融合至 Venus YFP 的新型冠状病毒生物素化刺突 RBD 蛋白 (RBD-vYFP) 以及候选 Sybody 均由 Markus Seeger 教授（IMM，苏黎士）和 Linkster Therapeutics AG 慷慨提供。Matthieu Botte 博士 (leadXpro) 慷慨提供了人血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 的纯化、组氨酸标记的胞外域。

参考文献

1. van Heeke, G. et. al.2017.Nanobodies as inhaled biotherapeutics for lung diseases.Pharmacol Ther.169, 47-56. doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.06.012 
2. Zimmermann, I. et al.2018.Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife 7:e34317. doi: 10.7554/eLife.34317
3. Walter, J.D. et al.2020.Sybodies targeting the SARS-CoV-2 receptor-binding domain. bioRxiv doi: 10.1101/2020.04.16.045419