通向热量计大师之路 Vol.4

接下来让我们测量蛋白质和化合物。由于暂时不知道亲和力，我们将蛋白质设为10 μM，化合物设为100 μM，并按照通常的方法进行测量。

曲线没有呈现S形。我是不是设错了浓度…每次滴定时的稀释热几乎相同，DP值为0.015 μcal/sec，很小。此外，比样品最后一次滴定时的热量还小。也就是说，样品的生热量非常小。这样直接相减是否可以…

中村，你好像遇到麻烦了。

深田老师，是的。我测量了蛋白质和化合物，但没有画出S型曲线，而且获得的热量似乎非常小。

是这样吗，中村，你在测量前用过模拟软件吗？

啊，您之前提到的iTC200控制软件附带的那个吧。对不起，我没有用过…

手册上有记载哦，您可以看看P.39。

好的，我会看看。

此外，这次测量的样品似乎亲和力较弱。

是的，可能是几μM。

你的浓度是怎么设定的？

我将蛋白质设为10 μM，化合物设为100 μM。

假设K_D为5 μM，尝试模拟一下情况如何？

哦，呈现S形。不过浓度设得比我用的高。

是的，这是模拟软件推荐的浓度。那用你设定的浓度模拟一下怎么样？

因为我用了10 μM的蛋白质和100 μM的化合物…

噢！没有呈现S形！

是的，当预见K_D时，这样先模拟确认，再测量更好。

原来如此，模拟软件真方便！

那么有个问题。这是牛碳酸酐酶与结合的小分子Sulfanilimide和AMBSA的ITC测量数据，你怎么看？

上面的Sulfanilimide图看着像是S形，但下面的AMBSA图似乎是直线，没有呈现S形。

是的。那么为了使其呈现S形，该怎么做呢？

嗯…之前降低浓度导致无法呈现S形，所以提高浓度对吗？

对了。顺便说一下，Sulfanilimide的K_D大约是8 μM，AMBSA是10 μM。

可以模拟一下。

之前图中的浓度未能呈现出充分的S形。不过，老师，模拟结果中小瓶的浓度较高。如果无法配制出这样的浓度，应该怎么做呢？

中村，你还记得C值的设定范围吗？

设定范围？

请再看一下手册。写着什么范围是理想的？

哦！？理想范围是5～250，允许范围是1～1000。（请参见简明手册P.7～8）

没错。模拟软件中可以更改C值。可以模拟使用已经配制的样品浓度进行测量的情况。

原来如此！这是实验设计，对吧？

没错。那么中村，未来可能需要测量亲和力更低的化合物，我会告诉你测量和分析的要点。

好的！请多多指教！！

看这些数据，中村，你怎么看？这是蛋白质和片段的相互作用…

没有呈现S形，所以通过提高浓度来进行测量对吗？

假设这个实验结果是小瓶的蛋白质浓度为30 μM，而片段为3 mM，那么会怎样？

什么？片段浓度这么高吗？而小瓶的蛋白质浓度不是很高…

那再看看手册。P.9.。针对亲和力弱于100 μM的实验系统设计。

没有呈现S形。

对，亲和力很弱时，呈现S形的浓度设置可能很困难。可以模拟一下吗？

哇！1 mM的蛋白质是不可能的！！

是的，所以此时，按照手册，将蛋白质浓度设为预测的K_D的1/5～1/100，且保证10 μM，滴定样品浓度为K_D的10～50倍达数mM，后期滴定中使蛋白质完全饱和。看看前面数据的规范化曲线的横轴，是否看到值很大？

是的，但这样不会呈现S形…

是的，目前状态下无法求得结合比和焓变。这时需要在分析上做些调整。

一些调整？？

是的，手册中写着，进行“假设结合比的”分析。如果样品呈现1:1结合，理论上认为结合比为“1”可以吧？

理论上应该是这样…

在拟合时结合比是S形曲线的中点，输入初值为“1”并取消“Vary?”勾选，这样可以设定为常数。解析软件将此作为曲线的S形拟合部分使用，变曲点处为一个摩尔比为1的位置，模拟出S形，结果求得K_D和ΔH。

真是这样啊！

这有个前提是，样品浓度100%活性，请注意。

好的！

通过这些中村便能够实际测量样品，学到了针对不同特性的样品准备、测量和分析方法。当出现异常反应时，不要强迫解析，请考虑其下特征以及可能原因。
接下来我们介绍异常数据的解释和应对方法。

【博客附记】
你觉得ITC咨询最多的问题是什么？答案是“滴定注射器清洗时溶液无法流动”。这个解决方法在热量计大师之路 vol.2中提到。

滴定注射器玻璃的损坏、滤波管适配器的连接不良、O-ring的老化，最近还出现另一种故障原因。

那是洗涤模块背面的滤网堵塞。

通过更换此滤网，可以解决问题。如果根据“MicroCal iTC200滴定注射器无法流动清洗水时的处理方法”指示未见改善，请更换此滤网。系统发货时附有滤网。

但系统发货时间可能导致滤网在洗涤节点内部看不见，这种情况下请联系我们技术支持。