迈向量热计大师之路 Vol.4
掌握优化ITC实验的能力！
此处出现的人物与故事纯属虚构。
关于技术内容，我们得到了大阪府立大学客座研究员深田先生的建议。
※在本文末尾可以下载资料。
【上次的故事】
丸番制药的仲村先生接到上司田中先生的指示，启动了量热计。在深田老师的指导下，掌握了iTC200的测量和分析的基本知识。
【这次的故事】
已掌握基本技能的仲村先生首先决定测量手边的抗体-抗原。抗原是购买的分子量约50 kDa的蛋白质，抗体则是自行准备的。根据其它测量结果预估亲和力约为数nM。
查看论文等发现，大多数情况下，通常在细胞中放入抗体，在针管中放入抗原。根据C值(＊1)计算，若KD为数nM，浓度太低，需确保至少10 μM才可以。而1:1结合所需抗原为100 μM，抗体是二价，因此抗原需200 μM。嗯？抗体5 μM，抗原100 μM也可以吗？为了节约样本，尝试低浓度测量。首先从控制实验(＊2)做起。根据日文简易手册P.9的条件，每次滴入2 µl，滴入18次。不过，初次滴入为0.4µl。
※1 关于C值的解释可参考《迈向量热计大师之路Vol.2》。
※2 关于控制实验可参考《迈向量热计大师之路 Vol.3》。
总觉得稀释热有点大，是这样的么？无论如何，先测量样本。
控制实验几乎没有变化？！测量后半部分的放热量也没有收敛为零……缓冲液应使用相同组成的，所以不太可能是缓冲液错配……是针管脏了？不不，测量前进行了系统检查，这不应该。深田老师～。
仲村先生，怎么了？
其实，我的样本是抗原和抗体，但测量后发现，两者的数据几乎没有差异。
哇，真的。如此一来，测量的是什么都不知道了。考虑过原因吗？
DP值设置的参考功率5 μcal/sec没问题，因此确定不是细胞污垢的问题。考虑到滴定响应有问题，怀疑是不是滴定针管脏了，但测样之前进行了系统检查，没有问题。所以才认为是缓冲液错配，然而缓冲液是使用相同成分的。因此不太可能。
你刚才说「使用相同成分的缓冲液」。难道没有通过透析样本？
是的。这次，抗体是自己准备的，但抗原是购买的，没有载体。我使用了与从凝胶过滤制备抗体相同成分的缓冲液来调整抗原的浓度。
那么，未进行透析。抗原是在凝胶过滤的缓冲液中制备的吗？
严格来说，是用另行制备的缓冲液调整抗原浓度的。但成分应该是相同的。
仲村先生，这样的话，可能缓冲液成分有所不同。即使声称成分相同，由于试剂的称量等肯定会存在微小偏差。即便是同一天制备的，日期变更后也可能会有所变化。此外，使用是无载体的冷冻干燥产品吗？是否确认了在配方时的条件？有时可能使用了TFA或乙腈，这些残留成分可能会对pH等产生影响。
什么！？真的是这样吗！？
若希望细胞样本与滴定样本的缓冲液成分尽可能一致，透析是非常重要的。尤其是对于那些购买的或自己未制备的产品，为了排除更多的不确定因素，最好与抗体一起进行透析。
明白了。我会透析后重新测量。ITC是一项如此精密的工作…
我补充一下。“严格匹配细胞和针管的缓冲液成分”对于ITC测量非常重要。在控制实验中，如果检测到大的热反应并且随着滴定进行而发生变化，则可能表明配体溶液与缓冲液之间存在错配。当然，针管干燥时使用的甲醇如果干燥不充分，也需要注意。
在实验前请仔细检查缓冲液匹配情况。如果即使细心进行了缓冲液匹配，控制实验中的结果趋势仍无法消除，则可能由于针管内配体的聚集或自缔合所致。在这种情况下，需要重新审视测量条件。此外，对于无法透析的小分子配体，通过透析高分子后在透析外液中直接溶解配体来制备即可。但在溶解含有添加剂或盐等残留成分的样品（合成肽或合成核苷酸等）时要特别小心。溶解后，请使用pH计检查溶液的pH。如果配体溶液的pH与缓冲液的pH相差超过0.05，应使用少量HCl或NaOH溶液调节配体溶液的pH。通过控制实验可以将由盐浓度的小变化引起的热变化差扣除。此外，使用具有质子解离基的小分子配体时，即使在数mM的浓度下进行测量，缓冲成分如10 mM等浓度差不大的条件下，可能无法获得足够的缓冲能力而影响pH，请注意。
次日……
透析完成。浓度调整完成！pH无偏差。样品放置推出测定！！
控制实验的稀释热保持稳定。样本测定结果在测定后期得以收敛到稀释热！透析很重要！接着解析是吧
拟合效果良好！KD为6nM，结合比为1.8。
仲村先生，获得了相当不错的数据呢。
是的。我重新认识到透析的重要性！
那是的。那么这次，如何扣除控制数据的呢？
按照手册，用原始数据进行了扣除。
正是这样。
补充说明。手册建议使用原始数据进行控制实验的扣除。当稀释热保持不变时，如果控制实验的噪声较大，可以扣除平均值来应对。根据情况选择操作方式。
那么现在提问。这幅图是扣除控制原始数据后的数据，但是解析中存在问题。你觉得是哪儿出了问题？
拟合效果不佳？
是的。那为何拟合效果不好呢？
模型有误？
不，我想不是模型的问题。你觉得哪里拟合得特别不好？
是在测量后半部分的平坦处？
是的。那是为什么呢？
……我不太明白。
进行拟合时，解析软件会计算测量后半部分的热量收敛到零。从这个数据看看，测量数据的绘图高于零？而红色拟合线的末尾却是零。
啊，真的！确实如此！
那么仲村先生，为什么扣除了控制后，测量结果还未归零呢？
控制实验的稀释热与样本测量的稀释热有差异，控制实验的发热量较大，扣除后结果为正，是这样吗？
没错。那么在这种情况下，建议选择哪种解析方式呢？
嗯，我不太清楚。
如若这些差异无法准确扣除以致获得这样的数据，有时可以应用一些高级技巧，如编辑数据以使得拟合曲线后段值归零后再进行解析。
高级技巧！？那该如何进行呢？
我认为使用Y Translate功能效果会很理想。
Y Translate？
顾名思义，是一个用于纵轴值移动的工具。请参阅文档了解操作方法。
Y Translate操作方法的资料，请在本文末的表单填写必要信息并下载。
是的。谢谢。
对解析软件的熟悉也需要积累……有没有更详细的解析手册呢？
有的。可从马尔文官网（英文版）下载PDF文件（需要注册马尔文网站会员）。
具体介绍了解析的例子。所有数据都保存在交付的电脑中。此外，还介绍了解析时使用的拟合公式，请参考。
Y Translate完成。拟合会好吗……
滴定后半段的点与拟合数据的偏差减小了！
仲村先生，通过这一点，您又深入了理解吗？
是的！
顺便提一下，仲村先生。这次测量使用了什么缓冲液？
抗体制备过程中使用了磷酸缓冲液，因此ITC测量也使用了磷酸缓冲液。
是吗。那么请问仲村先生，如果pH相同但缓冲液成分不同，您认为获得的都是相同的数据吗？
啊！？
例如，这次使用磷酸缓冲液，如果使用相同pH下的HEPES或Tris会怎样呢？
嗯……一般在改变缓冲液时实验结果可能会出现差异，因此我认为会有一些不同……
是的。实际上，这方面的提示在日文简易手册中有哦。
真的吗？
请查看P.5关于缓冲液成分的部分。
啊，真的，缓冲液存在质子化焓的差异呢。但实际差异到底有多大呢？
现在测量阶段告一段落，何不边喝茶边聊呢？（详情请参考深田老师专栏3）
好的！谢谢深田老师！！
