通往热卡专家之路 Vol.3 等温滴定型热卡法 iTC测量及分析重点！

by Malvern Panalytical, Tuesday, 1st September 2015

此处出现的人物和故事均为虚构。
技术内容请参考大阪府立大学客座研究员深田教授的建议。

【前情提要】
丸番制药的仲村女士根据上司田中先生的指示开始操作热卡，但困难重重。她带着想要确认的内容，向深田教授请教。一步步解决难题，深入理解ITC的现象及原因。

深田教授，我打算先尝试一遍操作，所以请您指导！

是的，明白了。让我们试试吧。

系统一直开着电源呢。电源需要提前多久开启？

是的，我一般都会保持开启。这使得系统更稳定。不过，每个研究室都有自己的规则，建议提前一天设定温度，至少要提前一小时启动。如果想让基线更稳定，那就要提早开启电源。当然不要忘记设定测量温度！

明白了。接下来更换参考用超纯水。这一操作一周进行一次就可以。如果长时间不使用系统怎么办？还需要更换吗？

如果不打算使用，就不需要特意更换。不过，哪怕是水，放置久了也可能滋生不明物质，所以建议一个月至少更换一次所有池的超纯水。测量结束时请确保池里装有新鲜的超纯水。如果使池干燥，污垢可能会粘附在池内。

明白！接下来是系统清洗。手册上说要用控制软件的命令。选择Cell and Syringe Wash，根据屏幕上的指导进行即可。

是的。根据指导进行操作即可，不过如果想更彻底地清洗，也可以使用其他命令。手册中应有关于每个命令的解释，您可以查看。

手册的第42页。
想要手册的请单独联系我们。

对于我来说，每次样品测量后，我都用洗涤剂清洗池，如用14% Decon90或20% Contrad 70。在移除样品后，用气密注射器用超纯水冲洗，并用洗涤剂填充。要小心它起泡，如果样品污染严重，可以填入洗涤剂静置几分钟。除去洗涤剂后，重复几次Cell Water Rinse (Long)以完全清除洗涤剂。保持池清洁是获得良好数据的关键。

了解。那么，注射器清洗有何注意事项？

在常规清洗中，在完成干燥步骤后，应目视检查注射器玻璃部分和清洁位置内是否有残留水滴。如果有水滴，可能是干燥不够充分，甲醇会混入注射器样品。比如，即使测量水—水，仍然出现显著放热反应，则可能有甲醇掺入。这通常是由于装载填充端口适配器不充分造成的。

我对这个填充端口适配器还不熟悉，感到担忧。

可能是这样，但使用两三次之后就会熟悉了。另外关于注射器清洗，尽管没有甲醇残留，但如果测量中水-水仍有热反应，则可能是滴定注射器中有污物。参照手册用洗涤剂清洗。

是第42页。注射器已干燥完毕，现在充填样品。没有水滴。为了防止气泡混入，样品需提前恢复到室温。如果此时样品有气泡，最好进行脱气处理，对吗？

就iTC200而言，大致不需要脱气。不过，如果看到明显的气泡，轻轻离心一下即可。

明白，需要灵活处理。然后将EDTA填入样品池，并将CaCl₂填入滴定注射器。没有气泡，参数设置也OK！开始！DP稳定后即可开始滴定。

好的，我们观察一下。

这次，仲村已经先设定好夹套温度，所以注射器很快就开始旋转。请注意，测量温度与实际温度相差较大时，注射器不会很快开始旋转。

教授，基线稳定化通常由系统判断，但手册指出个人也可判断…

软件对基线稳定的判断，可能导致在轻微漂移时就开始测量。由于iTC200的信号噪声比不错，这种漂移影响不大。但需了解为何基线不稳定。

外界温度如空调对系统的影响，做好防范是首要的，对吧？

是的。还有其他原因，如邻近有强磁场影响。空调或磁场影响时，会出现规律性漂移。同时，池内混有气泡时也会造成漂移。这些可能从一开始气泡就存在，也可能由于池污染导致产生气泡。当气泡被注射器的样品排出时，基线会呈上升趋势，或者气泡被排除时，基线突然上升。

在开始测量时，DP必须在设定值的±1 µcal/sec范围内。

是的，但±1 µcal/sec作为标准略显宽松，越接近设定值越好，现在基线快稳定下来了？

对，附近是9.7 µcal/sec。测量开始了。估计要1小时，休息一下？

等一等，仲村小姐。现在离开不太合适。

哎！？

至少，等到第二次滴定结束。

到第二次滴定，都要等吗？

基础线DP值合格，但还有两个检查点。

两个！？

首先需确认设定的参考功率是否适合目标相互作用。通常生物大分子相互作用，设为5 µcal/sec即可。我们这次因是EDTA与CaCl₂，所以设为10 µcal/sec。第一次滴定量小，第二次开始则为实际滴定量。

补充，设定滴定参数时，首滴量为正常滴定量的1/5左右，因为滴定前注射器与样品池接触，导致界面样品浓度降低。首个滴定数据不用于分析，而用少量样品填充，开启正式测量。
参考功率设定为10 µcal/sec专用于EDTA和CaCl2的反应。生物大分子如蛋白质的初期滴定反应热≤-1 µcal/sec，设5 µcal/sec即可。即使设更高参考功率，也可能增大噪声。