迈向热量计大师之路 Vol.8
用DSC测量RNase A！(第二部分)
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本文涉及的人物和故事均为虚构。
关于技术内容的建议，由大阪府立大学荣誉教授深田先生提供。
通过页面底部的“下载”按钮，可以下载本文中提到的VP-DSC分析步骤。
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| 第二天早上，中村先生到达实验室时，系统已经完成了第10次扫描，正在降温。 |
 | 控制测量的基线很稳定。当温度降到大约30℃时，取下压紧盖，填充样品。使用ThermoVac进行样品的脱气，使用定时器。脱气完成后，取下压紧盖，设置压紧传感器上的压力插头。此次不使用填充漏斗，直接将配有鲁尔盖针筒的针头小心插入，不碰到底部，从样品池中抽出缓冲液。完成脱气样品的装填。经过15分钟的预扫描恒温后，进行最后平衡。DP值接近零，没有问题！ |  |
 | 中村先生，进展顺利吗？ |
 | 是的，DP值似乎没有问题。现在只需等待测量结果。 |
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| 顺便问一下，你更改了扫描次数吗？ |
 | 啊，我忘了。需要将数字更改为11，然后点击“更新运行参数”。好险。 |
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| 即使在测量开始后也是没有问题的。不过，我担心在获取数据时发生问题。 |
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| 我会铭记在心。 |
| 测量结束后，用Origin7.0实时绘图点击“完成的扫描”按钮，显示如下数据。 |
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| 中村先生，你获得了相当不错的数据。 |
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| 谢谢。但是，基线有上升趋势。这似乎在水-水测量时也如此。这没问题吗？ |
| 这种倾斜被认为是由于样品池和参考池的体积并不完全相同，这是系统固有的漂移。然而，在DSC实验中，总是从样品测量的数据中扣除控制测量的数据，因此，如果漂移一致，则相消，无需担心。 |
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| 因此，数据的好坏取决于这一基线的倾斜一致性。 |
 | 没错。 |
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| 如果倾斜不一致，可能是因为泡沫混入了池中？ |
| 是的。如果基线重复性差，首先要怀疑泡沫。泡沫的原因可能是池污垢引起的。 |
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| 保持池干净对ITC和DSC都很重要！ |
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| 是的，保持池干净非常重要。另外，如果缓冲液的成分不同也会导致基线漂移，所以要注意。 |
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| 还有一个要点。重要的是样品的响应低于控制的响应。这次也是如此。 |
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 | 是的，但…为什么呢？ |
| 比较控制与样品溶液，后者因为有蛋白质，所以水分子的摩尔浓度较低。因为水的热容比蛋白质高，所以含量较大的会释放更多热量。 |
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| 我明白了。如果样品高度超出预期，可能是什么原因呢？ |
| 这可能是由于缓冲液成分略有不同所导致的。 |
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| 那么现在清洗系统并关闭它。 |
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| 辛苦了。接下来是分析。 |
| 好，我会按照手册进行。 |
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| 哎呀，桌面上没有这个图标…… |
 | 根据您购买的时间，可能桌面上没有MicroCal, LLC DSC图标，而是有MicroCal Analysis Launcher系统。 请双击该图标，然后从MicroCal Data Analysis Click button to Start中选择VP-DSC。后续操作与手册一致。 |
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| 顺便问一下，目前有10次扫描的控制数据，我该使用哪个？通常应该使用最接近样品测量的控制数据 ，对吧？ |
| 中村先生，您怎么了？ |
| 有10次扫描的控制数据，在这种情况下，应该使用最接近样品的第10次扫描吗？ |
| 是的。扫描次数越多，重复性越好，因此在这种情况下，第10次扫描就可以使用。然而，如果最后一次控制测量中数据出现尖峰噪声，则可能需要选择前一次测量的数据。 |
| 好的，明白了。谢谢。那么样品是第11次扫描，控制是第10次扫描，将会调用这两个文件。 |
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| 注意) 在软件中显示的是 Kcal/mole， 但应为kcal/mol。 | |
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| 中村先生，分析看来也没有问题。 |
| 是的，但有两个ΔH，值接近，但哪个是应该采纳的？ |
| 中村先生，这个问题你之前问过吧？ |
| ？？？ |
| 这就是卡路里测得的焓变（ΔHcal）与凡特·霍夫焓变（ΔHvh）的区别。 |
| 啊，我忘记了！ |
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| 有v标记的ΔH是凡特·霍夫焓变。这次的数值接近，所以RNase A应该是进行两态转变的蛋白质。 |  |
| 是这样的。在这种情况下，可以使用双态模型进行分析。 |
| 顺便问一下，老师。测试套件上有特别注明“数据分析方法：从0开始整合”，这是为什么？ |
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| 分析软件中有一种功能，可以使用从基线中减去后得出的巅值信息来求焓变和Tm。 |
| 补充说明。从0开始整合没有记录在日文简易手册中。当我们进行拟合分析时，先编辑数据，但在基线减去之前的操作未变。在此之后的步骤如下。 |
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| 哎呀！？Tm和NDH与拟合的值有所不一致！ |
| 从0开始整合的Tm是寻找峰顶，而拟合是在拟合得出的峰面积的一半处找温度。NDH也是如此，从0开始整合是实际面积，而拟合的是拟合后的面积（红线数据），因此可能会有一定偏差。拟合结果和测得值之间有些差距，对吧？ |
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| 是的。顺便问一下，关于这个差异，在哪个范围内被认为是可以接受的呢？ |
| 我以前问过Malvern方，他们表示如果SE在2%以内则无碍。 |
| ΔH为1.026E5 cal/mol（1.02 kcal/mol），因此其2%是2052 cal/mol，所以409 cal/mol在可接受范围内。 |
| 的确如此。 |
| 补充说明。正如之前提到的中村先生的问题一样，测量方可以选择用拟合方法求得参数，也可以不用。对于双态转变的样本，拟合结果和“从0开始整合”的结果通常很接近，因为双态转变的样本通常会得到左右对称的峰形，因此接近峰顶。非双态转变时不一定左右对称，因此面积的1/2不一定是峰顶。重要的是，保持使用相同的方法进行分析和比较。 |
| 这种方式，中村先生成功完成了使用测试套件的测量与分析。 下次我们将介绍故障排除与维护。 |
在下方按钮下载文章中提到的“VP-DSC数据分析步骤”。
(与第一部分中的下载内容相同。)
