Zetasizer Nano ZSP 测量蛋白质电泳迁移率

使用Zetasizer Nano ZSP 的蛋白质电泳 迁移率测量 

 

 

简介  

 


Zetasizer Nano 是在动态光散射和电泳光散射技术领域中测量流体动力学尺寸和电泳迁移率的领先产品。 

 

动态光散射（DLS）是一种广泛用于蛋白质及其制剂特性分析的方法，使用该方法不仅可以测量分子尺寸，还可评价稳定性。 

 

最近，随着蛋白质被迅速应用在生物疗法中，溶液中蛋白质的稳定性引起了科学界和商业界的广泛关注。为了制作安全并可商业化的产品，了解制剂的稳定性及行为至关重要，对能够分析这类特性的工具需求正在日益增加。 

 

使用电泳光散射（ELS）测量的蛋白质的迁移率是用来确认制剂的行为和粘度稳定性的特性指标之一。
 

实验上测量蛋白质迁移率提供了两个实际挑战。 

 

（i）处理蛋白质溶液意味着处理大多数稀释浓度。DLS这一术语可能意味着处理与小分子成比例的低水平散射光。目前大多数基于光散射的设备对于此类测量所需的敏感度不足。 

 

（ii）为了测量蛋白质的迁移率，必须施加电场，这是一种可能促进聚集和损害蛋白质的物理处理。因此迁移率测量结果反映了分子的聚集现象而非被测蛋白质本身。 

 

准确且精确地测定蛋白质迁移率需要以下三个条件：
1. 设备需具有足够的灵敏度以同时测量与蛋白质稀释液相关的低电泳迁移率和低计数率。
2.测量技术应能降低聚集发生的风险。
3.智能自动测量程序可识别并最小化聚集的发生。  

Zetasizer Nano ZSP（ZSP，图1A）及其相关软件专为满足这些要求而开发。该设备在测量低可以达到1mg/mL浓度的样品迁移率时，通过其光散射灵敏度，使得小尺寸颗粒和低浓度样品分析成为可能。此外，ZSP使用的相位分析轻微散射（PALS）技术提高了低迁移率样品的测量表现。  

 

美国马尔文仪器公司科学家发现，电泳测量过程中的多数聚集现象发生在电极上。借助马尔文发明并已申请专利的扩散屏障方法（图1B），可以将蛋白质样品从电池电极中分离并保护。 

 

这意味着可以施加长时间的电压以获得更可靠的数据。扩散屏障方法参照了用于纳米尺寸生物材料迁移率测量的最新ASTM标准。 

 

Zetasizer Nano ZSP的Zetasizer软件还包含专用于蛋白质迁移率测量的协议。这些测量方法通过降低电压并谨慎控制电池内的温度以防止样品聚集。 

 

在测量迁移率之前和之后，系统会使用完全相同的光学设备精确测量尺寸。因此，测得的尺寸分布直接表示出迁移率测量的群体。如果使用不同的光学设备来测量尺寸，则由于光散射强度可能会改变，可能无法识别形成的聚集体，因此建议使用相同的光学装置进行尺寸测量。通过在迁移率测量之前和之后使用相同的光学设备测量尺寸，Zetasizer Nano ZSP识别出可能在测量过程中发生的任何聚集现象。 

 

最后，通过精确测量蛋白质的电泳迁移率，可以基于已知的蛋白质迁移率和电荷之间的关系计算蛋白质的电荷。 

 

利用Zetasizer软件中的新计算选项可以进行计算。这份应用笔记将介绍使用ZSP测量蛋白质迁移率。通过使用有效的ZSP灵敏度、扩散屏障方法和合适的测量协议，可以获得尽可能准确的测量值。
 

方法
 

人血清白蛋白（HSA）使用两种缓冲液（buffer）配置为最终约2mg/mL的浓度。使用的缓冲液条件如下。 

 

1）蛋白质原先溶解在的pH7的缓冲液，2)柠檬酸盐缓冲液(pH4.3)。为了消除聚集体的影响，测量前通过0.02μm过滤器过滤样品。 

 

借助扩散屏障方法，可以防止样品因与电池电极接触而聚集。在一次性折叠毛细管(cell)中加入适量缓冲液。利用胶体装载移液器的尖端在电池底部的光通过部分放置20μL HSA（2mg/ml）。在设备中加载细胞后，测量尺寸和zeta电位。 

 

HSA的流体动力学尺寸和迁移率分别通过Zetasizer Nano ZSP以DLS和ELS测量。确认测量的zeta电位源自蛋白质而非凝聚物，尺寸和迁移率均在相同散射角下测量。 

 


结果 

 


图3A和3D显示了实验开始时pH 7和pH 4.3条件下测得的样品尺寸分布。如预期般，尺寸分布图仅显示一个峰。pH 7情况下尺寸为3.8nm，与报告的HSA尺寸良好契合。 

 

有趣的是，pH 4.3下尺寸为4.1nm，稍大于pH7。这是结构变化或更高水平寡聚反应的表现，还是聚集现象的初步表现，无从判定。 

接着开始测量样品迁移率并计算结果。图3B和3E显示迁移率测量中的频谱图。研究频谱图是一种评估测量质量的好方法。 

因蛋白质较小，其扩散速度极快。电泳测量过程中，蛋白质虽处于电泳状态，但扩散速度未完全被电泳战胜。 

因此散射光的频谱偏移包含显著的扩散成分，导致呈现宽峰。聚集体更大，因此含聚集体样品的频谱图扩散成分显得更小，峰更高更尖。这在应用笔记MRK1651-02及参考文献中更详细描述。此频谱图呈现宽而低的峰，指出测量主要针对蛋白质而非聚集体。

在pH 7下，测得HSA电泳迁移率为-0.88±0.2μmcm/Vs，pH 4.3下为0.44±0.2μmcm/Vs。结果证实了样品的等电点存在于两pH点间。 

测量电泳迁移率后，利用Zetasizer软件的新计算器从测得的流体力学尺寸和电泳迁移率中计算蛋白质总电荷。图4所示，pH 7下计算得HSA电荷约为-18，而pH 4.3下计算得电荷约为+10。 

图3C和3F显示了迁移率测量后样品的尺寸分布。结果显示测量过程中的少量聚集。在两种情况下，分布的主峰分别占pH 7下散射光的99%、pH 4.3下样品的90%。 

因此，基于这些迁移率的计算结果是可靠的。pH 4.3的样品显示在无电场下随时间聚集，可能源于低pH。此效应也解释了测量中少量聚集的发生原因。

여러 가지 추가할 수 있는 부분은 문헌 [6]에서 설명됩니다.