LALS 为什么越近越好？- Viscotek GPC 系统

 

引言 


  目前在GPC/SEC(凝胶渗透色谱/体积排除色谱)实验中测量分子量时，广泛使用激光光散射检测器。 

分子量可以直接从LS（光散射）检测器信号中测量，这种优势使得不需要用聚合物或标准蛋白来校正洗脱体积。

很多用户都偏好这一方式。而且通过LS检测器测得的分子量与聚合物的类型和结构无关。这就是使用GPC-LS测定分子量的原因。该方法被称为绝对分子量。然而，实际上所有GPC-LS检测器都需要进行校正。目前使用的大多数LS检测器通过数据外推或数据校正来获取分子量，因此称其为绝对值会存在显著的误差。

 

本应用笔记解释了该问题的理论，并描述了LALS（低角光散射）是否是唯一一个与分子量成正比的散射光角度的实际测量LS技术。 

光散射理论 

首先，需要了解测得容量（散射光强度）与所需结果（重量平均分子量）之间的关系。这两个参数通过雷利方程连接。 

当Rθ=0表示0度的散射强度，Mw是平均分子量，c是溶液的浓度，K是光学常数，表示dn/dc，A2是第二维里系数。

在低浓度溶液情况下（例如：一般的GPC条件），浓度很低可以忽略这种影响。因此公式变得简单。

使用简单公式可直接从散射光值中计算Mw。但应理解此方程是在0度（例如：0°）的散射光有关。由于入射激光束导致不可能在0°测量散射光，因此需要在其他角度测量散射光。例如，图1显示的，使得散射光量随着散射角和测量的分子尺寸变化大，过程变得复杂。

当分子大小非常小时可忽略角度相关效应。当分子尺寸大于12nm时容易出现问题。”

根据此理论，基本上有三种解决方案。

1. Multi-angle Light Scattering (MALS). 安装两个或多个角度测量散射光并外插到0度.

2. 90度光散射/黏性(RALS/粘性).

包括用90°测量散射光并用粘性数据校正0°值.

3. 低角光。在接近0°的低角测量以忽略角度效应。这种情况不需要校正。

MALS和RALS/Viscosity使用的数百种设备正在全球广泛使用，但其中没有设备可以直接测量分子量。

这种Multi-anlge方法总是依赖数据外插，而RALS则需要粘性计进行大分子数据校正。

历史上在首次校正后直接测量分子量，因此没有像Multi-anlge方式那样需要估计和数据处理的需求，LALS一直被认为是唯一的绝对方法。

商用LALS检测器在70年代末至80年代库存品基准Chromatix KMX-6生产。但是90年代没有生产LALS检测器。

直到2001年才发布新的Viscotek LALS检测器以便GPC-LS用户能够直接测量绝对分子量。

多角度方法有问题的原因

多角设备原则上通过在两个或多个角测量散射光并外插到0度。然而，大多数用户认为该测量值是绝对分子量。

然而所有MALS设备都需要经过校正程序，因此事实并非如此。而且，分子量不是直接测量，而是通过数据外插得出的。

这就是MALS方法最大的弱点。外插需要各种类型的数据绘图或外插拟合，应对每个样本分别应用哪种类型？使用Debye？ Zimm？ Berry？ 对于低分子量的样品，使用线性数据拟合是最准确的。分子的尺寸越大，所需的数据拟合越不同(2)。

对于大于45nm的分子，数据绘图将为曲线形式，且外插分子量将因选择的数据拟合而有所不同。 即使在小分子和大分子二者都存在的样本中，也始终会受到选择拟合顺序的影响。

这种依赖兼具多角度方法的另一个问题是其缺乏关键低角数据。由于多角度检测器在不同角度采集数据，因此无法在真实低角度采集精确数据。这使得获得精确分子量变得困难。外插精度（拟合的适合度）取决于最低角度数据点与0的距离以及信号的质量(3)。

低角度光散射(LALS)

先进的LALS方法尽力在0度附近进行（这里为7°）散射光测量，避免所有外插和数据拟合问题。

图2展示了检测器的光学路径内部模型图。这种有效的设计有效区分了入射束中的散射光(4)。因此，可以在7°获得极佳的信噪比。

图3比较了90°（RALS）和7°（LALS）的低分子量聚合物和高分子量聚合物的信噪比。

从图3a可以看到，对于低分子量PEO样品，无论散射角度如何，两个检测器都能获得相同结果。色谱图显示90°信号（RALS）与LALS的信噪比比较结果显示LALS具备优越的信噪比。

LALS直接测量的重要性在分析多糖等大型分子时最为明显。这类分子对散射光的角度依赖性很高(见图3b)，用RALS和特别是多角方式进行测量时容易出现严重的问题。

在7°直接测量散射光可以避免外插和数据拟合，并能产生准确的分子量。图4展示了使用LALS方法对透明质酸样品的测量结果(5)。

结论

通过现代LALS检测器的出现，GPC/SEC实验室能够更准确地测量样品的分子量。通过使用LALS可避免与数据外推或数据拟合相关的问题。新发布的LALS产品尺寸小，易于操作，方便地应用于带粘度计的集成多重检测系统中(6)，同时能够确定分子量和分子结构(7, 8)。

这颠覆了“角度越多越好”的传统认知。实际上，测量散射光时距离越近越好。