书籍摘选文章：利用等温滴定量热仪（ITC）进行分子间相互作用的热量评估

实验医学别册「为了创新药研究的相互作用解析完美指南」（生命科学和医学的专业出版社 羊土社 出版）第1章 创新药中的相互作用解析标准 – Ⅰ 低中分子药物 – 5 (长门石晓，津本浩平著)中刊登了涉及ITC的文章。本文章已获得羊土社的许可。

利用等温滴定量热仪（ITC）进行分子间相互作用的热量评估

长门石晓，津本浩平

实验的目的和要点

等温滴定量热仪（ITC）是检测分子间相互作用中热量变化的装置。通过分子间相互作用的热量变化，可以直接了解非共价结合的热力学性质，因此可以获取通过筛选选择出的种子和命中化合物的结合方式和特异性的信息。此外，在结构优化中，还可以通过热力学参数精确分析相互作用是否根据设计策略发生。结合结构信息，可以精确检验设计指导方针，并将其连接到下一个设计策略。

简介

在小分子药物开发中，小分子的蛋白质结合是其特定相互作用方式的关键。因此，在探索、验证、优化的每个步骤中，获取其特定见解非常重要。分子间非共价结合的形成、蛋白质的立体结构或构象变化，以及因其在水溶液中而导致的水合状态变化，都是放热和吸热反应的因素。因此，在靶向分子的相互作用解析中，热测量提供了重要的指标。等温滴定量热仪（isothermal titration calorimeter：ITC）是唯一能观察相互作用热量变化的解析手法，且可高精度地进行热力学分析。ITC 的基本使用方法请参考第1章-13。

优化：由于通过验证预计到了靶蛋白的特异性而确定了命中。从这个命中化合物，通过骨架的延长以及官能团的添加/改良，提高结合亲和性和功能活性。这些构造展开称为优化。

在小分子药物的优化中，介绍一项关于热力学见解有用性的回顾性重要研究。将艾滋病治疗药物HIV蛋白酶抑制剂的靶蛋白热力学参数总结在图1A中^1，2）。在此图中，将自初期（1996年）批准的IDV起，十年间开发的各抑制剂按照批准顺序排列。随着新抑制剂的批准，表现出针对靶蛋白结合亲和性较高的趋势（ΔG负值较大）。值得注意的是其热力学处罚（图1B）。

初期的药剂（如IDV）是以结合焓（ΔH）不利而结合熵（ΔS）有利的熵驱动型。然而随着药剂的优化，热力学参数的平衡从熵驱动型转为焓驱动型（图1B）。在初期的抑制剂中，熵的贡献较大，而新批准的抑制剂则主要来源于焓的贡献。此外，这些抑制剂之间也存在ΔH－ΔS补偿的相关关系。此类趋势也可见于高胆固醇血症治疗药物他汀类，骨质疏松症治疗药物双膦酸盐制剂等^3，4）。以上结果表明，与靶蛋白的高特异性，即焓驱动和熵驱动的双重贡献在药剂优化中是重要因素。通过这样的药效提升中进行的结构优化，解读官能团如何在热力学上贡献是了解分子靶向药质量的极有用见解。导出哪种官能团对焓有贡献，哪种对熵有贡献的普遍性并不容易，但验证热力学参数，合理设计药物被认为是为靶蛋白制定低分子设计的特异性创造性提供重要信息的。

准备

基本的调制方法请参考第1章-13 。在使用化合物时，由于常常包含DMSO，需要特别注意制备以避免浓度波动。

协议

基本操作和实验步骤请参考第1章-13。一般推荐在细胞侧放置蛋白质，在注射器侧放置化合物。

对策

注意DMSO引起的热量变化
当使用化合物时，常因含有DMSO而成为测定体系，偶尔会观测到超出预期的反应热或稀释热。DMSO在ITC中对相互作用的反应热有影响。细胞侧样本制备和注射器侧样本制备是分别进行的，需特别注意以避免DMSO浓度偏差。微小的DMSO浓度误差可能被观测为稀释热，导致想检测的相互作用热无法观察到。一定要进行化合物稀释热测定，以尽可能减少DMSO源的热量变化进行样本制备。

实验例1：利用ITC测定的竞争测定法探索^5）

在发现能与创药靶点蛋白特异结合的小分子化合物中，覆盖蛋白质表面的化学空间探索是一个高效且有效的筛选方法。因此，受到关注的是使用小于300Da的一般化合物库的平均分子量的片段库进行的创药策略。然而，片段化合物的化学结构相对简单，可能对蛋白质的结合亲和性低，解离常数可能达到数mM。这使ITC能够成为一种有效的评价方法，因为它能够进行高灵敏且物理化学的解析方法。如前述HIV蛋白酶抑制剂的例子，在特异结合中多能观察到显著的放热反应及反应的收敛。这类表现通常期待有氢键的形成。另一方面，非特异性的相互作用常以不收敛的反应热出现，疏水性相互作用则以吸热反应出现。因此，对于命中化合物群中表现放热反应的化合物，采用将其作为更有力的候选的筛选策略是可取的。当结合位点在靶蛋白中明确确定，且己知结合位点结合的底物或小分子配体等时，竞争测定是一种有效的策略。利用ITC进行竞争测定，可以筛选出结合位点特异性且表现放热反应的命中化合物（图2）。以下是笔者实践的具体例子。

1. 靶点蛋白

靶定酮类甾体互变酶（KSI）及3-氧-Δ5-氢化酮类甾体异构酶（催化3-氧-Δ5-氢化酮类甾体转变为具有激素活性共轭异构体的酶）。

2. 小分子探索

通过SPR筛选从片段库中对KSI筛选化合物。

3. ITC 竞争测定（SITE）

对从筛选获得的命中候选化合物进行ITC竞争测定，进行有效的命中验证。这种解法通过将获得的化合物与已知配体分子一起添加到目标蛋白质的溶液相互作用中，并观察其反应的方法（图2A）。当片段化合物在目标结合位点相互作用，加入结合亲和性更高的已知配体（去氧胆酸糖：DOC）作为阳性对照化合物将片段化合物排开，进而在结合位点稳定化。当片段化合物伴随着放热反应相互作用时，DOC结合的片段化合物解离反应表现为吸热反应。

为了提高通量性，设计了可以通过一次滴加评价热量变化中竞争测定的SITE法（single-injection thermal extinction）。利用SITE法进行了KSI片段化合物结合的命中验证。结果表明，KSI与基质DOC竞争，同时具有显著放热反应的焓驱动型命中化合物得以获得（图2B）。另外，研究还成功地从MAPK级联中参与的激酶蛋白ERK2中获得了同样的片段筛选化合物。

由此可见，ITC不仅在药剂的优化中发挥作用，而且在探索阶段热量评估也能大展身手。通常认同放热反应在非共价结合中产生特异性，通常包括氢键。然而氢键的合理设计被认为比较困难。在初期药剂设计阶段，发现有氢键形成的小分子化合物并从中进行合成开发是导向高质量前导化合物的有用手法。

实验例2：小分子优化中的ITC解析^6）

1. 靶点蛋白

靶定被认为与帕金森病和癌症密切相关且备受关注的蛋白DJ-1（图3A）。DJ-1被认为是一种具有甲基乙醛酰活性的酶，但这些酶活性与疾病的相关性尚不明确。因此本研究希望通过获取对DJ-1阻害性的化合物，明确DJ-1酶活性与疾病的关系并为新治疗手段提供桥梁。

2. 小分子探索

通过SPR筛选从几个命中候选化合物中选出。含有异靛化合物的化合物群被选为有望的命中候选（图3B）。

3. 命中验证（ITC）

对命中候选化合物进行ITC测定，显示异靛为对DJ-1具有放热反应的焓驱动型（ΔH＝－11.6kcal/mol，－TΔS＝4.1kcal/mol，K_D ＝3.2μM）结合模式的化合物（图3C）。通过公式ΔG＝ΔH － TΔS计算得出－TΔS，通过K_D ＝1/K _A得出K_D。通过DSF（差示扫描荧光法）对DJ-1的热稳定性进行解析，显示异靛也提高了DJ-1的热稳定性。

4. 结构解析

对异靛和DJ-1的共晶结构解析显示，异靛与多个氨基酸侧链形成共价及非共价结合，形成与DJ-1的独特复合体结构（图4A，B）。基于该结构信息进行变异体解析显示，在溶液中异靛与结晶结构相同的结合部位相互作用（图4C）。

5. 化合物的优化

基于复合结构信息尝试提高化合物的亲和性。结果表明，化合物#15实现了nM级的结合亲和性（图5）。化合物#15对熵有贡献（ΔH＝－11.5kcal/mol，－TΔS＝2.0kcal/mol，K_D ＝0.1μM）。该化合物也提高了对DJ-1的稳定性。对于获得的命中化合物，在细胞内的抑制活性进行了验证。结果显示异靛和化合物#15均有效抑制了细胞内的甲基乙醛活性。此外，值得注意的是这些化合物通过细胞基本热移位分析（CETSA）也显著提高了细胞内DJ-1的热稳定性。以上结果表明，利用ITC验证可以选拔出特异性的焓驱动化合物，并通过结构优化使构造补体创造与熵的贡献相关。这种ITC方法在细胞内特异性作用于靶标蛋白的化合物选择上是有效的。

结尾

本文中介绍了利用热测量发掘小分子药物的研究例。在小分子抑制剂的发现中，传统的选择标准为高生物活性、抑制潜能并结合高活性。然而，大多在未明确靶标分子与小分子药物的具体相互作用下进行探索，从而有时会为最终的骨架设计或结构优化活动-结构关系不佳等问题带来挑战。此外，近年来靶向分子（主要为蛋白质）不再仅限于酶或受体，还包括膜蛋白或天然无序蛋白等生化处理难度大的靶标。处理难度大的目标分子常挑战到以往的药物探索方案或测定系。其次，小分子抑制剂不一定拥有如酶底物口袋般明确的结合部位，可能还需作用于蛋白-蛋白间相互作用（PPI）或巨大蛋白复合体聚合界面等，特殊性提升为更多问题。要为这些靶蛋白特异结合的化合物选择适当的检测技术，必需能敏锐且定量分析结合情况。这些种种挑战中，分子靶向药物开发中最问多的要点即是与靶分子的高结合亲和性及特异性创造。因此，需更准确的勘探及解析技术，并作为其中一种，本文解读了ITC的有用性。尽管本文未介绍，笔者曾在其他小分子抑制剂探索中化ITC应用例选拔出来自疟疾感染及癌症靶标关注的丝酰驶酸代谢酶（SHMT）低分子抑制剂化合物，揭示了分别为焓驱动和熵驱动的命中化合物^7）。ITC热特性曲线分析为命中化合物的特异性以及结构优化阶段的合理分子设计提供有用的手段。

◆ 文献
1） Ohtaka H & Freire E：Prog Biophys Mol Biol, 88：193-208, 2005
2） Muzammil S, et al：J Virol, 81：5144-5154, 2007
3） Carbonell T & Freire E：Biochemistry, 44：11741-11748, 2005
4） Kawasaki Y, et al：Chem Pharm Bull (Tokyo), 62：77-83, 2014
5） Kobe A, et al：J Med Chem, 56：2155-2159, 2013
6） Tashiro S, et al：ACS Chem Biol, 13：2783-2793, 2018
7） Nonaka H, et al：Nat Commun, 10：876, 2019

马尔文帕纳尔公司等温滴定量热仪（ITC）
MicroCal ITC系列请点击这里