通往热量计大师之路 Vol.10 最后回合 关于热量计的方方面面 专业对谈
 | 我们邀请了大阪府立大学的深田教授和大阪大学蛋白质研究所的李教授，来给我们讲述有关热量计的种种。从开始使用热量计的契机到当前的研究，还有经常收到用户的提问等，进行了深入对谈。 |
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1. 开始热测定的契机是什么？
 | 我的热量测定经验大约13年，但最初是自学从ITC开始测定的。契机是利用溶液NMR（核磁共振）光谱学的研究。在研究一种酶与其配对物的结合的过程中，发现了酶在氨基酸残基级别上的波动增大。一般认为结合后蛋白质结构会变硬，尽管结合位点的部分确实变硬了，但其他部分却开始呈现波动。因此，考虑到ΔG ＝ ΔH – TΔS的关系式，结合使蛋白质变软（波动增加）从而增加了系统的混乱度。我猜想通过增加ΔS（系统的熵），降低ΔG（吉布斯自由能变化）可能有利于结合反应。ΔH是焓变，T是温度。 就在那时，美国和欧洲开始有论文发表关于结合导致的蛋白质波动增加。有了这种背景，我提出了自己的观点，但当时其他教授并没有认可这种说法，说结合后不可能会发生波动。 因此，为了验证这一点，通过调研发现ITC可以测定ΔS，那时刚好我们实验室有MicroCal VP-ITC，于是开始通过查阅手册进行测定。通过不同温度下的ITC测定来求各温度的ΔH，此外，从ΔH的温度依赖性可以获得ΔCP（定压热容量变化），从而通过ΔCP及水的熵的经验式计算出脱水的ΔS。尽管关系式非常简化，但通过求解脱水的ΔS和ITC所测得的系统总体的ΔS，可以确定构象熵的变化。 这样，我可以通过ITC测定和分析结果，证明结合反应会增加酶的构象熵并稳定复合体，这与NMR的结果一致。近代热力学本来就是我学科中的最爱，尤其对反映自然流动的熵。 |
 | 我从本科毕业的论文时起就开始进行热测定。我的指导教授是日本第一个正式开始生化系热测定的高桥克忠教授。自然地，从那时起到现在，一直专注于热测定，没有改变过。 李教授也提到过，当他发布结合引起波动的说法时，没有得到认可，而约40年前，某些化学系的老师认为结合时熵增加是不可思议的。当然，如果与构象熵或水合完全无关，熵变化会是负值。 |
 | 说起来，从那时起，就开始有人讨论水的脱水作用或蛋白质折叠等问题，其中包括因脱水作用引起的熵变化。深田教授总结的关于缓冲液去质子化的焓变化的研究真是了不起。（参考文献1） |
| 因为我出身于农业学部，当我进行这种研究时，周围的人常批评道“这不是农业学部的研究！” 然而高桥教授非常喜欢这种研究，并给予了相应的支持。在专注于生物物理化学基础研究的实验室中，倘若不是教授的支持，这种测定也许就无法实现。 |
| 我认为像这样的基础性研究应更深入研究。 |
| 关于缓冲液, 这其实不是真正的基础；化学领域的研究人员不会使用这种系统。我获得的数据可以说是实用性的基础数据。 |
2. 最近的研究内容是什么？
| 我现在关注的是引发各种疾病的蛋白质聚集。蛋白质错误折叠和聚集相关的疾病被称为蛋白质错误折叠病。当蛋白质错误折叠并聚集时，容易引发疾病。阿尔茨海默病、帕金森病、II型糖尿病、普利病是典型例子。我开始研究时，相关文献和评论中记载的蛋白错误折叠相关疾病有20多种，而现在，这个数字已超过40种。尽管某些疾病患者人数不多，但与聚集相关的新病不断显现，聚集这一现象已变得不可忽视。 最近还关注胰岛素的研究。即使在酸性环境下降pH，胰岛素仍然稳定，几乎保持native like结构。当提高pH时，会从二聚体变为六聚体，形成复杂的结构，但在pH2时，没有金属离子存在时，以单体存在。用DSC逐渐升温测定，天然结构会热变性，转变为伸展结构。这时观察到DSC吸热反应（向上），继续升温会出现极大放热反应的下指DSC峰。然后响应会回到基线水平。 测定结束取出样本，发现形成漂亮的淀粉样纤维。尽管其他团队也有类似报告，但我正在研究不同的溶剂条件。奇妙的是，即便胰岛素聚集，仍可以用DSC测定。我尝试在其他聚集体形成反应中做测定，但很难获得再现性。我引入预制淀粉样纤维或聚集物进行DSC测定，但DSC的基线(Cp线)下降，数据失去可重现性。基线下降的原因至今未明，是个后续课题。升温会增加疏水相互作用，导致热变性后蛋白之间形成聚集体。聚集体之大容易沉淀黏附DSC池壁，影响DSC测量。但目前尚无共识。使用VP-Capillary DSC可以在一定程度上抑制聚集反应，因此适合研究球状蛋白稳定性。 因此，我开始使用ITC研究蛋白质聚集。搅拌池内样本可避免聚集体沉淀，聚集体不会变大。这样，确保聚集体亦可在溶液中分散，从而获得再现性佳的ITC测定数据。成功的案例包括，作为透析淀粉样变病原因的β2-microglobuin的淀粉样纤维形成（参考文献2 Ikenoue and Lee et al. PNAS (2014））。胰岛素同样用ITC进行聚集反应研究。我计划通过ITC和DSC研究胰岛素在所有可能的结构状态之间的动态热力学性质。从折叠开始的热，到天然结构转为三维结晶的热，或转为淀粉样纤维的热，单体转为二聚体和六聚体的热，以及金属离子结合时的热，使用ITC和DSC的综合测量都可以发挥作用。 综述这样的数据，我认为可以绘制出胰岛素这单一蛋白的结构变迁与分子间相互作用的热力学能量地貌图。 |
| 真是厉害。在我看来，胰岛素是非常怀旧的样本。在研究生阶段初次使用，是从购买的样品中去除锌，然后碱化调整至单体条件下进行的。在还原胰岛素二硫键时进行热量测定。 由于当时没有现在这样的热量计，通过杜瓦瓶和热敏电阻进行温度计测定，需要大约20 mL的样本量。 |
| 那真是需要大量样本呢。现在偶尔也有客户托付珍贵样本测试的情况。没有表达系统购买的蛋白或肽在一次测定中花费不菲，因此如果样本量减少就很有意义。 |
3. 从用户视角看ITC的进展
| 一直以来我主要是通过VP-ITC进行测定。有一次样本量不多，就去京都大学的白川教授那里借用iTC200进行测定。这时我感觉样本量减少、温度平衡速度加快、测量时间短还是挺不错的。现在在使用iTC200之后推出的PEAQ-ITC。每种MicroCal ITC系统都有其优缺点，但确实样本量少是有吸引力的。虽然热越小意味着拟合效果不太好，可能要提高浓度重新测定，但与VP-ITC相比，样本量更省，且温度平衡和测量时间惊人的快。有时一天能测10多次，真是了不起。测定聚集时会滴定1M NaCl，导致稀释热很大、滴定量大，VP-ITC会有测定上限。但在PEAQ-ITC中滴定量小，可以量化这种大稀释热，让我很吃惊。此外样本量少，反应更快结束，难以聚集的物质因测定时间短而不易聚集。此外，聚集具有概率性，样本量小更难聚集。用VP-ITC测定会途中聚集的样本，在同条件下用PEAQ-ITC测定则不聚集，测量快速而干净。 使用PEAQ-ITC也做了淀粉样纤维形成的测定。观察到非常干净的淀粉样纤维形成的反应热。然而，结果与VP-ITC不同，淀粉样纤维形成的滞后时间也不同。ITC设备的差异会影响形成，但也可能是由于搅拌、单元体积的不同，甚至单元内的细微凹凸等因素，总之，聚集形成反应可能是相当敏感的。 此外，PEAQ-ITC的清洗既自动又干净。在用VP-ITC测定聚集时，清洗不充分会导致结果不具再现性。残留的聚集物会影响数据，因此清洗要做到完全清洁。对于VP-ITC，通过手动清洗，加入表面活性剂后高温搅拌大约1小时，再用清洗附件进行最终清洁。然而对于PEAQ-ITC，只需点击自动清洗功能即可完成清洗，让人惊讶。不过，进行聚集形成测定后，推荐使用Soak功能，通过在单元中加洗剂并加热来进行深度清洁。即使在发生故障时，PEAQ-ITC也非常敏感。当清洗液流量或泵压小于正常值时，系统会报错。 这种错误提示能防止清洗液循环不良导致的清洁不完全。 |
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4. 从用户视角看DSC的进展
| 与ITC相比，DSC的开发似乎进展不大？不过在DSC测定样本浓度方面确实有很大进步。查看以前的论文，现在使用VP-DSC的话，样本浓度可以低至0.1 mg/mL。在90年代的论文中，并不算太久远的年代，写的却是10 mg/mL。有了VP-DSC，设备的灵敏度显著提高。 |
| 用于生物领域的设备在那个时代浓度是1 mg/mL。10 mg/mL用于普通的DSC。测固体或粉体的设备，其池不是固定型，而是放样本的小锅，和微量热仪不同。普通的DSC与微量热仪的区别在于，是否能测稀薄溶液微量热仪是为测稀薄水溶液而开发的。Privalov教授(Johns Hopkins Univ.)所开发的DASM就是这种热量计。大约1960年代末首次开发出来。70年代起，Privalov教授使用DASM的论文开始发表。MicroCal DSC为1977年开发的初代系统MC-1。 |
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| VP-DSC是1996年开发的，才使用硬币型池。在21世纪因产生了毛细管型的VP-Capillary DSC。 我借用过的MC-2需要大量样本，池容量约1 mL，总共需1.5 mL左右。当时蛋白浓度需1 mg/mL以上。那时起，DSC测定的浓度标准即为1mg/mL，但由于VP-DSC的出现，所需浓度开始降低。先前热测定只有很少的人接触，对比后确实更广泛普及。 以前是使用自制的量热仪。上市的好产品不断涌现后，扩散面更大。美国在很早前知名度已高，认为在日本应是1990年代发展起来。真正普及是VP-DSC问世之后。 |
5. 热量测定仍高不可攀？ΔCp是什么样的数值？
| 由于优良商业量热计的问世，我认为测定者增多，但仍然可能少有人实际尝试。以这种意义，我想有针对生物大分子特化的测定数据集会不错。 |
| 大约15年前出现了一本英文版的蛋白结构稳定性手册（参考文献3） 但过去15年的数据未有整合。此外，过去15年中使用DSC进行蛋白质热稳定性的论文，按最近趋势似乎在减少。许多研究球状蛋白质结构稳定性和protein folding（蛋白质折叠、蛋白折叠反应）的人，转到protein misfolding和aggregation领域及应用研究。 |
| 从DSC来看，有许多关注的问题是寻找Tm（热变性温度：天然蛋白与热变性蛋白各占一半的温度）值。尤其是做结构解析的不仅研究结构，还通过DSC求热稳定性。对于工业应用来说，制备热稳定性好的蛋白还是很重要的。热稳定性提升多少。若要加以讨论，最好能获得热力学量，这点尚很难。当然对ITC也有兴趣，但ITC比DSC需要更多样本量。若有区别，仅通过Tm或KD即可，对于能获取多少热力学量，可能许多人不知道。 |
| 比如，ΔCp是用于蛋白质特性描述的。是具有独特值的物理性质。就像人有不同性格，蛋白质有特性价值，人因此以ΔCp值理解蛋白质。蛋白质是氨基酸串联而成，从链状折叠成具有功能的三维构造并维持形态。球状蛋白的折叠原理简单说，是因为讨厌水的疏水性氨基酸残基避开水，而亲水性氨基酸残基维护与水接触。喜欢油的疏水残基埋藏于蛋白质，而表面亲水残基通过与水的氢键形式结合折叠。ΔCp大致与内部埋隐疏水残基数呈比例。脂肪较多的人ΔCp可能较大。 但即使是native state也不形成三维结构的天然变性蛋白存在。其具有疏水残基少而亲水残基多的特性。因此天然变性蛋白不像球状蛋白那样三维折叠，而在水溶液中游走不定。这使得天然变性蛋白的ΔCp偏小于球状蛋白的可能性较大。或许因为不具结构，但至今尚未有基于DSC研究天然变性蛋白的ΔCp。我曾用DSC测定过帕金森病相关蛋白的α-突触核蛋白，作为天然变性蛋白，它即使升温也没有热变性峰，与缓冲剂的热程完全一致。也就是说ΔCp几乎为零。天然变性蛋白据说占真核生物的蛋白质30%以上，是一种重要蛋白，通过研究ΔCp作为指征其物性是关键。这样也能用ΔCp这种物理量来解释球状蛋白与天然变性蛋白之间的分类。 |
| 得到物性值是非常不容易的。尤其是蛋白质，样本本身也需符合要求才行。准确的浓度首先必须决定。 |
| DSC测定若基线取得非常干净，尽管不进行拟合分析，前后变性得出的基线进行直线获取Tm处的ΔCp然并非不好，但通过单一DSC的热程获取信赖度诚实不高，因此想要正确求得，最好在不同温度下进行DSC测定，通过所得各温度的Tm和变性ΔH求得ΔCp，这样结果似更为准确。 |
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| 但这算是真正的ΔCp吗？ |
| 确实存在这种顾虑。估计含有“假定”。现在我自以为想明白了许多事，但通常蛋白质变性使用的是双态讨论。然而，DSC升温过程中，吸热峰前被定义为天然态、峰降下后的为变性态，但我觉得温度使得天然态和变性态结构不同。然而不考虑这些，进行双态，正如老师所说，拟合出ΔCp，是否真是ΔCp我们也无从而知。这是一种双态变性假定下能大概求出。Privalov教授也研究了热变性前天然态的ΔCp线的温度依赖性。可能当时聚焦于温度引起的天然结构之异同。 |
6. 请通俗理论讲解通过热量计可获得的参数！
| Cp是指，在一定压力下（ΔCp即p），使某物质升高1℃所需的热。ΔCp大的话，表示需要提供大量热来升高1℃。可尝试换个表述，“对热的耐受力”吧，我是这么想的。 在讲授物理化学课时，介绍吉布斯自由能（G）、熵（S）、焓（H）等热力学参数时，我会举类似人类的例子。学生们很高兴听。为达成某目标，需降低G以使ΔG为负，或说熵是想令自己舒适（自由）之心，焓则是达目标须忍耐的能量。讲解KD或分子间作用亲和性（相性）可拿做情侣关系举例合适。ΔCp例如标识某人的忍耐力，由调侃（添加热），若一个人就生气即为ΔCp低（生气导致温度高升）。不能忍耐（积累）。ΔCp高则即使连续戏弄（加热）能忍耐（不怒则热量难以上升）。 这样的话，我想深田教授是一位非常ΔCp高的人。 |
| 真不知是夸还是贬(笑)。 |
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| 不少人光听物理化学、热力学字眼就觉折服了。所以确认学生们的反应，逐步解释清楚有帮助。 |
| 说到ITC，相对容易的是从测定结果中读出亲和力，但在得出ΔH和ΔS后，论述这些参数是许多人觉得难度的事。ΔH提供关于氢键等相互作用的信息，S则是透明自由所信息。我教学生们这样做类比。以氢键主导结合会让ΔH呈负（发热）吧。如果是喜欢的人就合十（即结合发热）。合掌引致拘束S为负。同时，若有人靠近一个所被监控层层者的特定人物，监控人员职能解除而能自由活动，比如疏水性作用应该是如此。疏水相互作用的贡献大，则ΔH为正（解除监控即需能量即温度下降即吸热），同时ΔS为正（摆脱角色束缚获自由即自由度增加）。 |
| 是的，然而ΔH与ΔS的关系存在例外，影响因子远多于此，要简单解释着实不易。因我们测定的分子间结合反应的ΔH其实是“表观”的ΔH，其中含有解离、去质子化、分子结构变化、及非单纯结合反应的多种ΔH的贡献，而又不仅影响ΔH也影响ΔS终致影响ΔG。全然讲述这些令初学者难以亲近，因此宜逐渐进步友善。首先理解KD，继而结合同义。添入变异因素的蛋白虽与wild-type结合亲和力和结合比近似乎区分结合样式，但若ΔH和ΔS迥异则揭示不同。然后通过分析能获得较为可靠的结果，比如揭示结合位非一，而是二。 |
7. 获取信赖数据的重要因素是什么
| 即使存在样品，得到的数据也是值得信赖的。因易于走神始终准确的数字想宣告。我对解释处以外的数字本身有兴趣，因此尽可能几次重复测定。 |
| 是的。我认为样品优先确保重要，当然也须确认可重现性。他法所获得的结合信息非常有意义。以ITC测定而言，强结合或弱结合都可探测，而结晶结构解析则主要探测强结合，因判定重现性要领会两者特征。ITC观察到的弱相互作用若结晶结构解析未检出亦不足为奇。此外，像PEG之类crowder的加入于促进结晶形成时的molecular crowding effects（分子拥挤效应）或排除体积效应影响分子间结合反应，需要充分考虑。此时也可尝试crowder存在条件下的ITC测定。 |
| 在测定时普遍注意事项就是保持内部清洁，清洗。我每次测定后必使用洗剂清洗。不需抽吸，仅需放置一会。若内部污垢积累基线噪声增加，注意避免这种情况时的测定。 |
| 的确。我也对学生们严格要求清洗单元和注射器。而在测定时仔细记录也很关键，记录测定/溶剂条件和基线DP值/模式。当非常异常时，可以检查设备工作状态。设备状态不佳时获得的结果信赖度自然降低。 |
8. 阅读资料分析解读数据时的参考文献
| 谈及DSC或ITC相关的热力学会让人想起Sturtevant教授(Yale Univ.)、Privalov教授、Cooper教授(格拉斯哥大学)、Freire教授(John Hopkins Univ.)、Ladbury教授（利兹大学）。Sturtevant教授的论文即使在1977年写就（参考文献4），也堪称经典。讨论熵或热容量，至今仍为诸多研究者阅读。我认为对初学者而言稍许研究过热量计的人更能欣赏其内容。 | |||||||||||||||
| 诚然，在获取数据及其解读时查看下很有益。 | |||||||||||||||
| 以前演讲的Malvern网络研讨会（2016年6月）中参阅文献也有总结，供参考。「通往热量计大师之路」系列文章也值得一阅。9. 您今后希望进行怎样的测定？
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