N 值 ITC 数据

不要丢弃你的“坏” N 值 ITC 数据

N 值，通常被称为化学计量，是常用于判断滴定的“好”或“坏”的一个标准。理由是这样的——“如果我的 N 值与预期的化学计量（通常为 1）相差 20% 或更多，那么我的滴定结果就是无效的”。事实上，这并不总是如此。重要的是要理解 ITC N 值和化学计量（结合比）并不是一回事。如果我们用于拟合的浓度是正确的并且 100% 活跃，那么 N 值确实等于化学计量。N 值的一种表达方式如下：

此方程式中的三个值中的任意一个都可以改变 N，这意味着 N 是一个结合比的测度，与样品的活性一样。为了得到第三个值，其中两个值必须已知（或假设）。例如，如果对化学计量感兴趣，那么拟合中提供的浓度必须准确且100%活跃。如果对细胞中样品（通常为蛋白质）的活性感兴趣，则必须假设样品在注射器中（配体）的化学计量和活性浓度。

请看图 1：

提供的浓度为 20uM 的蛋白质（在细胞中）和 200uM 的配体（在注射器中），N=0.86。可能这两者中的一个（或两个）浓度不准确，可能的结合比是 1:1（N=1）或 1:2（N=0.5，两蛋白质：一配体）。如果我们假设是 1:1 且 200uM 的配体是正确的，那么用 17uM 的蛋白质重新拟合数据将使 N 达到 1，这意味着蛋白质的实际结合有效浓度为 17uM。在新的 PEAQ 数据分析软件中，任何三个未知数（N，[蛋白质]，[配体]）都可以设置为变量。

N 值可以轻松可视化为 ITC S 形曲线中间（拐点）的 X 轴值。有些滴定没有明显的拐点——它们要么是 1）低 C 值（平坦曲线），要么是 2）因细胞中的活性浓度太低或配体浓度太高而达到“过早”饱和状态。

1)      在低 C 值情况下，问题是弱的亲和力和低浓度导致平坦曲线。请看图 2：

Kd 处于中到高 uM 范围，但蛋白质浓度只有 50uM，这导致了平坦曲线。为了将其转化为具有明确中点的 S 形曲线，我们需要将蛋白质浓度提高到 10 倍（或更高）于 Kd。通常这不是一个选择，所以研究人员会使用所谓的低 C 值滴定——在此情况下保持蛋白质浓度低但增加配体浓度，以使曲线达到某种程度的饱和（注意高摩尔比）。这种曲线缺乏拐点，因此 N 值未知，必须在拟合过程中假设并固定为常数。

2)      在“过早”饱和情况下，问题是浓度不准确。N 值显得非常小。例如，图 3 中：

如果我们在拟合过程中允许 N 变化，我们会得到 0.0008 的值，这显然不是实际的化学计量。此外，dH 出奇的高（生物相互作用的 dH 很少超过 30 kcal/mol）。

如何从这样的滴定中提取可靠的 Kd 和 dH 数据？通过对假设的 N 的极端值进行拟合并记录 Kd 和 dH 的变化。例如，我们可以假设图 2 的化学计量在 0.1 到 5 之间，基于我们从这两种边界场景中得到的合理拟合质量。在这种情况下，Kd 变化很小，从 980uM 到 588uM。类似地，对于图 3，当 N 从 0.2 到接近 0 时，Kd 变化从 25uM 到 37uM。

即使非 S 形曲线分析起来更加具有挑战性，它们也不应被视为不充分的结果。Kd 值可能不能以绝对确定性得知，但即使在 N 值（以及因此的活性浓度）不确定性较大时，它们通常仍会收敛于相对狭窄范围内的值。

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