利用纳米颗粒跟踪分析法 (NTA) 确定荧光检测限

引言

当试图从复杂背景中区分特定颗粒子集时，检测纳米颗粒荧光的能力非常重要。可以对具有荧光的颗粒进行粒径和浓度方面的测量，了解这些颗粒的性质。这方面的典型应用包括了解给药载体的“归宿”以及了解生物环境中纳米颗粒的毒理学。此外，荧光标记抗体可用于特异性结合至样品中的靶颗粒，从而提供了一种识别未知样品中特定颗粒的机制。这在诊断应用中具有价值，如对外泌体和微泡的研究，同时在疾病检测中可用于识别和监测特定标志物。

NanoSight 系列仪器可以使用纳米颗粒跟踪分析法 (NTA)，在光散射模式下操作，能够显示和测量样品中的所有颗粒（因此无需荧光标记样品来进行测量）。此外，仪器也可以在荧光模式下进行操作，仅检测和测量荧光标记的颗粒。

NanoSight 系统可以使用 405 nm（紫色）、488 nm（蓝色）或 532 nm（绿色）激光源来激发合适的荧光团标记的颗粒，同时可以使用适当匹配的长波通滤光片和短波通滤光片对其荧光进行测定。

本应用文章通过一项实验来大致建立给定荧光团荧光检测限的基线。

众所周知，生物素与链霉亲和素的相互作用是一种非常强的非共价结合作用，K_d 约为 10^-14 mol/L。每个链霉亲和素分子存在 4 个可用的生物素结合位，构成四元结构的每个单体单位都含有一个。该比值用于计算每个金纳米颗粒可能与表面结合的荧光链霉亲和素分子的最大可能数量（图 1）。 

图 1：图显示了链霉菌素-生物素复合物的形成及其与金纳米颗粒的结合

材料

标称 80 nm 表面结合生物素的球形金纳米颗粒 (GNP) 购自 NanoPartz（产品代码 C11-80-TB-50），具有指定的生物素/颗粒密度。采用动态光散射 (DLS) 和透射电镜 (TEM) 确定颗粒大小，并制备为浓度约 9.4 X 10¹¹ 颗粒/mL。

采用 NorthernLights™ 557 荧光染料标记的链霉亲和素 (F*) 购自 R&D Systems（产品代码 NL999），储备液浓度为 1 mg/mL（约 10¹⁶ 颗粒/mL）。该染料在 557 nm 处具有吸收峰，在 574 nm 处具有发射峰。

方法

所有数据采集均使用 NanoSight LM10 系统，配备 532 nm LM14 激光模块、565 nm 长通发射滤光片、高灵敏度 (HS) sCOMS 摄像系统和 NTA 注射泵。使用 NTA3.1 软件对数据进行分析。

采用 0.02 μm 滤膜过滤的磷酸盐缓冲液 (PBS) 进行所有稀释。首先，通过连续稀释制备用于 NTA 的适当浓度的 GNP。通过在 PBS 中将原始样品稀释 100 倍来制备 GNP 工作储备液。取等分试样与 F* 一起在 PBS 中稀释，使整个样品体积范围为 1200-2000 µL，NP 浓度约为 4 X 10⁸ 颗粒/mL。制备样品，按 0-1000000 F*/GNP 的比例加入 F*，移取并混合。基于稳定的生物素-链霉亲和素复合物可以迅速形成的背景知识和初步实验结果，每个样品都要避光孵育 30 分钟，然后在室温下进行测量。

随后采用 NTA 在散射和荧光模式下测量颗粒的总浓度。不同测量类型中摄像系统的设置保持不变——一个用于所有荧光测量，另一个用于所有散射测量。NTA 注射泵用于确保在散射和荧光模式下进行慢速和恒定流量的分析，从而允许直接比较两种模式的数据。（注意：在荧光模式下，有必要进行流动分析以避免荧光团发生光漂白。此外，通过确保测量更大比例的样品来提高数据的统计稳健性）。在散射和荧光模式下，对每个样品拍摄了 3 段 60 秒的视频。

如表 1 所示，同时对一些对照组进行了测量。

假设和注意事项

这些纳米颗粒结合有生物素，指定密度为 2 个分子/nm² 颗粒表面。对于一个 80 nm 的球形颗粒，经计算的生物素含量为 40,000 个生物素分子/颗粒。

一个链霉亲和素分子具有 4 个生物素结合点，因此，如果每个金颗粒上的所有生物素分子都被结合，则需要 10,000 个链霉亲和素分子才能完全覆盖颗粒（100% 覆盖）。

当纳米颗粒与 F* 孵育时，假定 F* 均匀分布在所有存在的纳米颗粒上，这样所有颗粒都会结合了相同数量的 F* 分子。 

结果

在 50 a.u. 恒定流量下，最初在散射和荧光模式下测量金纳米颗粒。颗粒的 NTA 粒径分布图见图 2。

图 2：在 50 恒定流量下测量的生物素-金纳米颗粒的粒径分布图。仅显示光散射模式的数据，因为未标记的颗粒没有荧光信号。

为了获得合适的孵育时间，进行了初步的时程研究。按照相当于约 1000 个 F* 分子/纳米颗粒的比例，将纳米颗粒与 F* 分子进行孵育，并在室温下避光孵育不同时间。如表 2 所示，标记几乎瞬间完成，选择了 30 分钟孵育时间以确保生物素-链霉亲和素的孵育完成。

对不同比例的 F* 分子/金纳米颗粒进行测量时，在荧光模式下测量的总群体的百分比随着 F* 比例的增加而增大，直至达到“100% 覆盖”。所选比例数据见图 3。

图 3：在荧光模式下测量的 10F*/1GNP（绿色）、100F*/1GNP（蓝色）、1000F*/1GNP（红色）和 10000F*/1GNP（黑色）的粒径分布数据

当增加 F* 的比例超过“100% 覆盖”时，在荧光模式下测量的颗粒数量随着荧光量的增加而减少。图像背景变得更亮，更难以通过 NTA 软件对颗粒进行显示和跟踪。荧光模式下 NTA 测量的荧光标记颗粒的总体比例增加到至“100% 覆盖”，而在样品中进一步增加荧光会导致测量颗粒数量下降（图 4）。

图 4：顶部) 荧光模式下测量的 10000F*/1GNP（荧光团零过量，绿色）、11000F/1GNP（荧光团 1.1 倍过量，蓝色）、100000F*/1GNP（荧光团 10 倍过量，红色）和 1000000F*/1GNP（荧光团 100 倍过量，黑色）的粒径分布数据。底部) 荧光模式下 NTA 测量的荧光标记 GNP 的总体汇总。x 轴显示每个 GNP 的荧光分子比例（数据来自三次独立分析的组合）。

结论

本项简短的研究旨在探索 NTA 在使用已知亲和力的标准材料测量荧光标记颗粒方面的灵敏度。研究中提出了一些假设（金颗粒表面积、生物素覆盖程度、链霉亲和素完全结合、均匀样品孵育等），但证实在 5 个荧光标记链霉亲和素分子/金纳米颗粒的情况下，一些金纳米颗粒检测出存在荧光标记。在此水平没有测量获得 100% 回收率，原因可能包括：

1. 这些颗粒明显比那些具有更大负载的颗粒暗淡，因此其可能仅在较小散射体积中观察到。
2. 颗粒负载不均匀，即在 5F/颗粒的负载水平上，一些颗粒可能结合 10F，而另一些则可能结合 0F。可能仅较明亮颗粒才能被检测到。
3. 光漂白作用对荧光团数量较少颗粒的影响高于荧光团数量较多颗粒。   

在本示例中，每个金纳米颗粒结合 5F* 的颗粒非常暗淡，与结合 600F 或更多的金纳米颗粒相比，由于后者非常明亮，因此在荧光模式下显示和聚焦前者是一项挑战。  此外，在理论上“100% 覆盖”的基础上，将荧光分子比例增加超过 10%，会引起未结合荧光背景升高。这种背景升高使颗粒的显示和跟踪变得更加困难，因此随着荧光过量程度的增加，测量的颗粒数量也随之减少。

对于建立一个能够实现高荧光信号检测的标记实验方案而言，荧光团对靶纳米颗粒的滴定至关重要。样品中荧光团颗粒过少或过多均会影响 NTA 荧光测量的效率。

取决于所使用的荧光团及其结合效率、颗粒大小和激光波长，建议每个纳米颗粒至少需要 10-20 个有机荧光基团分子，才能使用 NTA 在荧光模式下成功实现对荧光标记颗粒的显示、跟踪和测量。