本应用报告检测了差示扫描量热法的使用，以研究各种人源或人源化抗体的热稳定性，从而观察稳定性对蛋白质表达和质量的影响。
稳定性对于研发治疗性抗体和基因抗体片段而言是重要的问题。 稳定性差可能会影响抗体在多种细胞中的表达水平，产生大量无功能的或折叠错误的片段产物，或随时间推移形成大的、具有潜在免疫原性的蛋白质聚合物。
在涉及几乎所有疾病适应症的人体临床实验中，抗体和抗体样蛋白质是被大量使用的分子实体，且使用量还在不断增加。 抗体是含有重链和轻链的异四聚体。 恒定区（CH 和 CL 链）含有不变的氨基酸序列，该序列取决于抗体分型和亚类。 相反，抗体可变区是极其多元化的，因此使抗体与任何一种外源性抗原的识别都具有高度的特异性和亲和性。 可变区的多样性源自可变重 (VH) 链和可变轻（VL，κ 或 λ）链的配对、可变区与恒定区之间大量的连接序列以及有体细胞高度突变。 可变区内的多样性还导致抗体之间的稳定性差异。
直到最近才有少量关于全长抗体的稳定性数据，这可能是因为它们是复杂的多结构域蛋白质。 在此，我们利用差示扫描量热法 DSC 研究了 17 个人源（人源化）IgG1 和 IgG4 抗体的结构域依赖的去折叠性质 (1)。 这包括了 Tysabri™（临床批准用于多发性硬化症的治疗）、I 期或 II 期临床实验中的 7 种 分子、2007 年作为试验性新药 (IND) 提交 FDA 的 4 种分子、以及研究中的 6 种分子。 这个数据集可作为参考指南，帮助抗体研发领域的研究人员了解热稳定性对于任一特定的抗体分子是否重要。
本应用报告的第二部分描述了将一个特别不稳定的抗体进行改造重获稳定性的过程。 经一系列稳定化突变后获得的一种 Fab，其 DSC 测得的去折叠温度变化中点 (Tm) 高达 92°C。 稳定化显著提高了抗体片段在大肠 杆菌中的功能性表达 (2)。
材料和方法
这些研究中使用的材料与方法如前所述 (1,2)。 使用 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 系统进行 DSC 工作。
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由于 IgG 的恒定区实际上是相同的，因此相同亚类的 IgG 在稳定性上的差异取决于 Fv 区域的差异。 为了研究人源或人源化抗体中存在的 IgG Fab 稳定性范围，特别是 IgG1 亚类，我们利用一组 18 个全长人源（人源化）抗体组开展了 DSC 研究，此抗体组名为 BIIB1-18。 根据 BIIB7 的 DSC 曲线显示，Fab 跃迁的 CPmax 值（即 DSC 峰的高度）大约比 CH2 或 CH3 区域高 3 倍（图 1A）。 4 种人源 IgG 亚类的典型 DSC 曲线如图 1B 所示，其中 IgG1 显示出最高的表观抗体 Fc 稳定性。 去折叠过程中的蛋白聚合对 DSC 测得的 Fab Tm 有影响 (3,4)；因此，对每个抗体进行的每次 DSC 扫描都是在完全相同的条件下进行的，获得的信息被认为是每个结构域稳定性的相对测定。
由于 Fv 区域的差异，BIIB1-18 在相应的热稳定性上的 Fab 跃迁变化也很大。 图 2A 中显示的 DSC 曲线说明了特定的 Fv 区域如何导致不同的 Fab 去折叠行为。 18 个 BIIB 抗体的 Fab Tm 值范围是 57.2°C 至 81.6°C（表 1）。 Fab Tm 值最低的三种抗体，BIIB15-17，表现出多个 Fab 去折叠跃迁，表明在去折叠的协同过程中存在一个阻碍（详见图 2A 的 BIIB16 的 DSC 曲线）。 这些抗体的 Fab 峰被分成两次跃迁。 T 较低的跃迁列在表 1。 对于 BIIB15、BIIB16 和 BIIB17，可能代表 CH1/CL 去折叠的第二次跃迁分别对应的 Tm 值发生在 74°C、72°C 和 70°C。
| IgG | Fab Tm (°C) | VH 亚类 | VK 亚类 |
|---|---|---|---|
| BIIB1 | 81.6 | VH1 | VK1 |
| BIIB2 | 78.5 | VH1 | VK1 |
| BIIB3 | 78.2 | VH1 | VK2 |
| BIIB4 | 77.7 | VH3 | VK2 |
| BIIB5 | 77.1 | VH4 | VK1 |
| BIIB6 | 76.8 | VH3 | VK1 |
| BIIB7 | 75.9 | VH1 | VK3 |
| BIIB8 | 75.6 | VH1 | VK1 |
| BIIB9 | 74.7 | VH3 | VK4 |
| BIIB10 | 74.7 | VH4 | VK1 |
| BIIB11 | 73.1 | VH1 | VK4 |
| BIIB12 | 71.2 | VH1 | VK4 |
| BIIB13 | 70.8 | VH3 | VK4 |
| BIIB14 | 70.6 | VH7 | VK-† |
| BIIB15 | 68.5 | VH3 | VK1 |
| BIIB16 | 68.0 | VH3 | VK3 |
| BIIB17 | 57.2 | VH3 | VK2 |
| BIIB18 | -* | VH3 | VK2 |
| * 不表达
† 异常的 κ，种系未确定。 经过 Elsevier（爱思唯尔出版社）的许可，转载自参考文献 (1)。 | |||
尽管 DSC 研究是用经过分子排阻层析确定的理想的异源四聚体蛋白进行的，但有着最不稳定 Fab 的抗体，BIIB17，其表达水平也很差且如果在 2-8°C 溶液中放置超过 1 周，就会聚合成高分子量聚合物。 每个 IgG1 的 CH2 和 CH3 去折叠跃迁叠加得很好（如图 2A 的典型 DSC 曲线所示）。 三个 IgG4 的 CH2 和 CH3 跃迁同样如此（数据未显示）。
BIIB7 的构建同时包括 IgG1 和 IgG4 两种形式。 IgG1 和 IgG4 的 CH1 序列有 10 个氨基酸差异（其中 6 个是保守的），且与 CL 有着不同的二硫键结合模式。 峰去卷积后，IgG1 和 IgG4 形式的 BIIB7 的表观 Fab Tm 值相似（ΔTm < 1°C，图 2B）。 这种相似性表明 IgG1 和 IgG4 之间的 Fab 热稳定性可直接比较。
普遍认为蛋白质可通过一致性设计而提高其稳定性 — 将稀有氨基酸突变成同源蛋白序列中发现的同义氨基酸。 DSC 测定出的稳定性最差的人源化 BIIB 抗体的框架中有着最高水平的稀有氨基酸，也支持了这一点。 为了研发抗体和抗体片段的稳定化策略，我们选择了一个表现差的 Fab 开展突变改造以增加 Fab 的稳定性。 我们从一种人源的，能识别破伤风类毒素 (αTT) 的 Fab 开始研究 (5)。 我们随机选择了 45 个残基位点。 这种饱和突变改造的详细情况在参考文献 (2) 中有介绍。
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| Fab | HC 突变体 | LC 突变体 | ΔTm* (DSC) | Δ表达† | Δ中点‡ (μg/ml) |
|---|---|---|---|---|---|
| WT | - | - | 0.0 | 1.0±0.4 | 63.0 |
| V1 | V1 V11L、S77T、F89I | - | 5.0 | 2.3 | 25.0 |
| V2 | V11L、S77T、T72N、A84L、F89I、G118A | D9L、N22S、W50A、N152G | 7.9 | 2.0 | 8.9 |
| V3 | S77T、T72N、A84L、F89I、G118A | D9L、N22S、W50A | 7.8 | 3.8 | 3.5 |
| V4 | V11L、S77T、F89I | N22S、W50A | 5.3 | 3.2 | 26.0 |
| V5 | V11L、S77T、F89T | N22S、W50A | 3.9 | 2.6 | 50.0 |
| V6 | V11L、S77T、F89I | N22S、W50H | 6.7 | 1.7 | 13.0 |
| V7 | S77T、G127A | D9L、N22S、W50A | 2.4 | 1.9 | 25.0 |
| V8 | V11L、S77T、T72N、A84P、F89I、G118A | D9L、N22S、W50A、N152G | 8.9 | 3.9 | 10.0 |
| V9 | V11L、S77T、F89T | W50A | 4.3 | 3.5 | 20.0 |
| V10 | V11L、S77T、T72N、A84P、F89I、G118A | D9L、W50A、N152G | 9.7 | 3.3 | 7.1 |
| V11 | V11L、S77T、T72N、A84P、F89I、G118A、G24A | D9L、N22S、W50H、N152G | 13.3 | 3.0±0.3 | 4.0 |
| V12 | V11L、S77T、T72N、A84P、F89I、G118A | D9L、W50H、N152G | 11.1 | 2.6 | 2.8 |
| * WT Tm = 78.7°C，扫描速率 = 1.0°C/min
† 野生型 αTT Fab 的大肠杆菌表达水平标准化为 1.0，它在三次单独培养中的平均表达量为 0.56+0.20 mg/L 培养物。 表达了两次的 V11 还 提供了标准偏差。 ‡ Fab 生物素化破伤风类毒素的 ELISA 饱和曲线中点的 Fab 浓度。 经过 Oxford University Press（牛津大学出版社）的许可，转载自参考文献 (2)。 | |||||
我们分别开展了 45 个突变 PCR 反应，并挑选出接近 4500 个单克隆，在含有表达介质的 96 孔板中培养。 含有 Fab 的上清在三个不同的温度下（70°C、72°C 和 74°C）进行热稳定性研究 (2)。 表现出热稳定性增强的变异体再次进行耐热性筛选，以确认其性质。
参考文献 (2) 提供了稳定突变的完整列表。 库中大约 1% 的变异体表现出热稳定性增强。 14 个“靶点”位于 VH 结构域，其余 4 个位于 VL 结构域。 这个结果提示，天然 Fab 的稳定性是受限于 VH 的临界稳定性的。 令人惊讶的是，在约 2000 个恒定区库成员中，未发现任一突变能从整体上稳定 Fab。 我们推测恒定区的稳定突变确实存在，但是 VH 区域的有限稳定性控制了 Fab 去折叠的温度，从而阻碍了我们发现这类活动的能力（详见下面的 DSC 实验）。
未能在 CL/CH1 结构域发现稳定化突变的另一个解释可能是，在升高的温度下 10 分钟的去折叠时间尚不足以完全打开恒定区。 Röthlisberger 及其合作者发现 CL/CH1 异源二聚体的去折叠非常慢 (6)，所有四种 Fab 区域的稳定性得益于这种动力学稳定。 因此，在热击的相对短时间内，恒定区有可能还未打开。
尽管在所有提高稳定性的 VH 突变中有许多与整体一致性并不匹配，但大多数突变确实与至少一个或多个其它 VH 种系中的亚类有一致性匹配 (2)。 例如，αTT VH 中的 72 位经过优化突变成天冬酰胺。 在所有种系 VH 亚家族中的共有残基正是同构的氨基酸-天冬氨酸。 在将库平板针对 72 位氨基酸残基进行测序之后，发现天冬氨酸是偶然未出现的。 此外，尽管 V89 在大部分人类 VH 亚家族中属于压倒性一致，突变成缬氨酸并没有改善 Fab 稳定性。 同配位的 VH2 共有残基苏氨酸在筛选中能显著影响稳定化 (ΔTm > 2°C)。 相似的 β-分支的异亮氨酸是筛选中发现的最强稳定化突变之一，它只是偶尔出现在人类 VH 序列的这个位置，并不是任何 VH 亚类的共有残基。
在 αTT VL 结构域内发现了 4 个稳定化突变体。 VK4 的共有残基 W50 突变成丙氨酸（VK1 的共有残基）或组氨酸是非常稳定的。 组氨酸非常少见于人类 κ 可变区内的第 50 位氨基酸，但人类 λ 可变区内却常常发现。 这个残基接近 VH/VL 结构域的交界。 我们推测，它对 Fab 稳定性的贡献可能与 VH 结构域潜在的支撑有关，因为 VH 结构域对 αTT Fab 稳定性的限制影响特别显著 (2)。 然而，单独的 VL 结构域研究结果却是截然不同的（数据未显示）。 曾有报道指出，此位点从酪氨酸突变成组氨酸能提高一个缺乏二硫键的 scFv 的表观稳定性及其表达 (7)。 因此，这似乎表明，在多数实例中，VL 框架 2
中最靠近 C 端的残基，亦即第 50 位残基上存在大的芳香基团并不利于 Fv 稳定性。
我们构建了 12 个重组体，它们分别包含初步筛选中鉴定出的 3 个到 11 个稳定化突变（表 2）。 合理地得出各种组合，以确定每种突变对 Fab 稳定性的表观贡献。
有趣的是，在平行进行的转化/表达实验中，多个稳定化突变的引入也增加了 Fab 的表达。 最佳的重组体与野生型相比，表达量稳定地提高了 3 倍以上（表 2）。 每个 Fab 的稳定性都是用 DSC（图 3）和圆二色谱 (CD)（数据未显示）进行评估的。 DSC 和 CD 扫描一般是不可逆的，加热后溶液非常混浊。 由于 Fab 的聚合，所测出的 Tm 值仅用于对 Fab 表观稳定性进行排序。
所有 4 个结构域的偶联去折叠是 Fab 的一个常见但不普遍的特征，前提是它们在分子内和分子间完全以二硫键相连 (1,3,6,8,9)。 基于单个结构域的内在稳定性之间的重大差异，多结构域蛋白去折叠反应中的去偶联并非罕见，取决于结构域相互之间的整体亲和力以及结构域之间的总相互作用表面面积 (10,11)。 在缺乏 Fab 任何部分时，其它结构域的去折叠可能无法偶联。 Rowe 和 Tanford 已证实 κ 轻链中的 VL 和 CL 在不与重链相连时，以解偶联的方式变性，并以分离的
结构域方式去折叠 (12)。 这表示与重链的其他关联对于协同性来说似乎是必需的。 Röthlisberger 及其合作者最近报道了全面而精彩的实验，证明不同稳定性的各种可变区如何能彼此独立地进行去折叠，而有着高稳定性和相似稳定性的可变区能够统一 Fab 的所有 4 个结构域的去折叠跃迁 (6)。 本文描述的最稳定 Fab 重组体 (Tm = 92°C) 似乎正处于与其可变区热去折叠反应解偶联的边缘。
所有 12 个 Fab 变异体的热熔解温度被用于对每种突变各自的稳定性贡献进行去卷积。 所有突变对 Fab 稳定性的贡献表现为叠加性的，即使这些残基中的一部分在初级序列上是相互接近的，且在 Fab 的三级折叠内也相对接近。 分析指示 4 种突变贡献了约 86% 的 Fab 稳定化。 VH 结构域内的 G24A、T72N 和 F89I 突变分别让 Fab 重组体的 Tm 上升了 3.0°C、2.8°C 和 2.8°C。 VL 结构域内的 W50H 突变让 Fab 的热稳定性上升了 3.5°C。
继序列框架突变之后需要考虑的一点是它对 αTT Fab 的抗原结合功能的潜在影响。 热稳定性突变来源于最初利用定量 ELISA 检测 CL 结构域以及 CH1 C 端的组氨酸标签的筛选。 一直以来人们常常推测，Fv 结构域的动力学可能对抗原结合有着深远的影响。 我们担心引入 Fv 框架区域的稳定性突变可能会干扰一个对于抗原停靠来说很重要的动态平衡。
热稳定性突变并没有减弱这个大肠杆菌所表达分子的功能，实际上还增强了 αTT Fab 在功能 ELISA 中的表观亲和力（表 2）。 在一个功能 ELISA 实验中，两个独立制备的野生型 Fab 用抗原滴定的结果并不一致，这指示细胞培养过程中的小差异可能微妙地控制了功能 Fab 的表达量。 两个野生型制剂产生的功能蛋白比大部分稳定化 αTT Fab 重组体要少。 每个 Fab 变异体的功能强弱表现为与 Tm 所描述的稳定性直接相关（图 4）。 当突变距离推测的结合环很远时，这些残基不可能直接增强了与抗原的接触。
基于野生型 αTT Fab 的行为，我们相信有一部分由大肠杆菌分泌出 的 Fab 组分是无功能的或者是错误折叠的形式。 从大肠杆菌分离出来的单个 VL 结构域与 BL21trxB(DE3) 的氧化胞质环境所表达 的 VL 有着完全不同的构象，这种现象与上面的解释是一致的（结果未显示）。 这也解释了 Fab 的分批生产所观察到的功能差异。
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利用 DSC 测定了 18 个人源或人源化抗体的热去折叠图谱，并发现了很大范围的 Fab 稳定性。 利用一致性设计，我们对一个特别不稳定的 Fab 进行了饱和突变，以改造其稳定性。 利用热稳定性分析的 Fab 库筛选让我们发现了 19 种稳定化突变，分布在 Fab 的 11 个位点。 稳定化突变的组合导致热稳定性的增加（高达 92°C），以及细菌表达的增加，还有不正确折叠和无功能物质水平的显著降低。 DSC 快速测定了对抗体稳定性起作用的因素，是一种宝贵的稳定性指示技术，能够应用在整个生物治疗药物的研发过程中。
本应用报告由美国加利福尼亚州圣地亚 哥 Biogen Idec 的 Stephen J Demarest、Ellen Garber、Gang Chen、Bruce E.Kimmel、David Gustafson、Jane Wu、Jared Salbato、John Poland、Marikka Elia、Xuqiu Tan、Ken Wong、Jay M. Short 和 Geneviève Hansen 编制。
