聚合物和多糖的物理性质及行为极大程度上取决于其分子本身的性质。 分子量和分子量分布、分子大小和结构都会影响物质的行为特性。 凝胶渗透色谱 (GPC)，又称为尺寸排阻色谱 (SEC)，是用来评估这些参数最常用的工具。
GPC 的工作原理涉及在样品流经多孔的惰性色谱柱基质时对样品进行分离。 较小的分子进入填料孔内，而较大的分子则被排除在外，因此可更快速地通过色谱柱。 结果是得到一个基于流体力学体积的分离，而我们想要知道的是样品的分子量。 以前，分子量是通过对比样品洗脱时间与已知分子量标准品洗脱时间进行估算。 而现在，光散射检测器是在不依赖保留时间的情况下对聚合物分子量进行测量的常用工具。 使用多角度光散射 (MALS) 和特性粘度进行的 Rg 并行测量提供了对合成和天然聚合物分子结构及其分子量的优异检测结果。
Viscotek SEC-MALS 20（图 1）是一种有 20 个角度的光散射检测器，可以测量分子量和 Rg（回转半径）。 该检测器可用作多角度检测器 GPC 系统的一部分，与光散射及其他检测器如示差折光 (RI)、紫外光 (UV) 和特性粘度 (IV) 结合使用，以同时生成大量的样品信息。
在此应用说明中，将采用 Viscotek SEC-MALS 20 测得的分子量数据与 Rg 和 IV 测量值相结合，用于研究不同多糖的分子结构，包括支链淀粉、葡聚糖、羟丙基纤维素 (HPC)、果胶和阿拉伯胶。 此外，还对构象图与 Mark-Houwink 图之间的差异进行了研究。
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将 SEC-MALS 20 检测器连接至 Viscotek GPCmax 和 Viscotek TDA 系统。 通过使用 2 根 Viscotek A6000M 色谱柱（葡聚糖、果胶和阿拉伯胶）或 1 根色谱柱（支链淀粉、羟丙基纤维素）分离样品。 流动相是磷酸盐缓冲液。 SEC-MALS 20 系统经 19kDa PEO 标准样进行校正。 检测器和色谱柱均维持在 35°C，以确保良好的分离并使基线稳定性最大化。
所有样品均以 0.5 至 3 mg/ml 的浓度溶解于流动相中，并以 100µl 体积进行进样。 葡聚糖样品的分子量已知，可用于检查校正结果。 所有样品均需溶解一整夜，以确保完全溶解。
所有样品均在系统内成功分离。 显示了果胶、阿拉伯胶和葡聚糖（图 2A）及支链淀粉和 HPC （图 2B）的 RI 叠加色谱图。
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作为一个更详细的示例，图 3A 展示了果胶的色谱图，显示了 RI、LS (90°) 和 IV 检测器的结果。 图 3B 显示了 SEC-MALS 20 检测器的角度数据。 从不同的角度可看出轻微的角度依赖性，允许对该样品的 Rg 进行测量。 图 3C 显示 RI 峰值与所测得的分子量、Rg、IV 和 Rh 重叠。
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| 样品 Id | 葡聚糖 | 果胶 | 阿拉伯胶 | 支链淀粉 | HPC | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 进样 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| Mn - (kDa) | 51.42 | 51.56 | 51.07 | 52.40 | 292.81 | 291.42 | 185.77 | 187.28 | 61.86 | 58.06 |
| Mw - (kDa) | 63.18 | 63.34 | 115.07 | 115.89 | 515.13 | 519.06 | 196.57 | 197.49 | 83.03 | 81.86 |
| Mz - (kDa) | 77.84 | 78.29 | 249.56 | 252.81 | 974.47 | 1,000.00 | 210.70 | 210.47 | 118.79 | 125.51 |
| IV - (dl/g) | 0.256 | 0.256 | 3.671 | 3.689 | 0.158 | 0.156 | 0.674 | 0.678 | 1.050 | 1.066 |
| Rh - (nm) | 6.06 | 6.07 | 16.97 | 17.06 | 10.26 | 10.21 | 16.63 | 16.70 | 13.98 | 13.93 |
| Rg - (nm) | 7.55 | 7.09 | 25.83 | 25.98 | 8.08 | 8.55 | 16.42 | 16.58 | 22.48 | 20.03 |
表 1 总结了不同样品的结果。 研究中进行了重复进样，每次进样之间的所有测量值表现出极佳的可重复性。
虽然研究数值结果是比对样品的一个不错的定量方法，然而将数据绘制在 Mark-Houwink 图和构象图上，从视觉角度来看也是一个快速比对样品的理想方式。 Mark-Houwink 图显示了作为分子量函数的特性粘度，而构象图则显示了作为分子量函数的 Rg 值。 因此，二者均可作为观察分子大小随着分子量的增加而增大的一个方式。 均可在不同样品之间进行即时比对，同时也非常适合于研究支化和其他结构变化。 而在本例中，我们只重点关注不同的多糖在曲线上的分布情况。
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在对 Mark-Houwink 和构象图进行研究时，结果中所包含的信息随即变得清晰起来。 阿拉伯胶是样品中分子量最高的，然而，它在两个图中的曲线却是“最低的”：在质量上，它是所研究分子中最小的（构象图）或是密度最大的（Mark-Houwink 图）。 虽然阿拉伯胶主要是多糖，但通常也含有蛋白质成分，这使其在仅增加了较小分子大小的同时增加了分子质量，所以上述结果也是意料之中的。
另一方面，果胶在两个图中的曲线都是最长的，这表明它是所研究分子中分散性最大的分子。 这与其在色谱图中拥有最宽的峰是一致的。 这一点在 Mark-Houwink 图上比在构象图上体现得更清楚。 由于显示了 Rg，构象图仅针对半径约在 10nm 的分子，该半径的样品光散射是各向异性的。 果胶分布图中包含了一些低于该半径限值的物质，无法测量其 Rg。 IV 不受分子大小的限制，因此可在整个分子量分布中进行测量。 作为两个图中“最高的”分子，果胶将其自身标识为所研究分子中最大（构象图）且密度最小（Mark-Houwink 图）的分子。
HPC、支链淀粉和葡聚糖分布于果胶和阿拉伯胶样品之间，表明其结构介于这两个极端值之间。
虽然这两个图给出的信息类似，但值得注意的是，其各自的优缺点使其适用的应用各不相同。 如上所述，构象图不可用于较小的分子。 然而，作为分子大小的直接测量方法，它并不依赖于任何形状模型。 如需将 IV 转换为大小值，必须假定一些形状模型，如表 1 中的 Rh 计算。
总之，在此应用说明中，所选多糖的分子量、大小和特性粘度是通过 Viscotek TDA 和 SEC-MALS 20 系统进行测量的。 然后绘制出构象图和 Mark-Houwink 图，二者均清晰地显示出不同样品的不同结构。 从数据可以看出，不同的多糖之间分子结构的差异非常明显，很容易观察出来。
以前，使用单检测器 GPC 系统无法得出此种程度的表征结果。 通过将光散射和特性粘度检测器与 GPC 结合使用，则可对天然和合成聚合物样品进行详细的表征。
