外泌体和微囊泡：使用NTA技术测定浓度，粒径大小和表型

简介

人们的关注点更多地集中在微囊泡和外泌体，因为它们正越来越多的被引用为一个潜在的生物标记。 虽然在这一新兴领域内的定义还不够正式，但这两类生物纳米颗粒都可以通过其粒度范围和生物起源加以区分。 通常，微泡的直径为100 nm至1 μm，而外泌体的直径为30 nm - 100 nm。 微泡一般是通过细胞质膜起泡形成的，而外泌体则通过核内体的多泡体胞吐作用释放出来。 两者似乎均参与细胞信号传导，可携带一系列信号传导蛋白以及信使RNA和微microRNA分子 两者在血液中的循环水平在众多疾病中都表现为增高，其中包括动脉粥样硬化和冠状动脉疾病、血液病和炎症性疾病、糖尿病以及癌症。

目前，外泌体的研究一直因缺乏合适的表征测试方法而受到限制。 马尔文的NanoSight系列产品采用独一无二的成熟技术而使这一需求得到满足。 纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术允许实时地对悬浮液中50 nm - 1000 nm直径范围内特定的外泌体和微囊泡进行逐个的直接成像和观察。 同时，NTA可提供高分辨率的粒度分布图表和浓度信息。 该技术易用、快速、稳健、准确且使用成本低，是对现有方法的一个良好补充。 在荧光模式下通过一系列不同激发波长的激光，可以对样本中的已经被标记的颗粒进行表征的测定和鉴别。

检测和测定细胞外囊泡的浓度

动态光散射（DLS）和NTA都可以通过斯托克斯-爱因斯坦方程式测定运动速度或扩散系数（Dt）与粒度有关的纳米颗粒的布朗运动。

使用NTA时，激光照射悬浮液中的颗粒，并用视频摄像机捕获所产生的散射光。 通过跟踪单个颗粒在二维平面上的位置变化来确定颗粒的扩散情况。 如果扩散系数（Dt）已知，就可以确定颗粒的流体力学直径。

下图显示出颗粒在溶液中进行布朗运动的情况。 初步目视检查表明，存在较大颗粒或聚集物（图1A）。 然后，NTA软件快速生成逐个颗粒的高分辨率粒度分布以及所观察到囊泡颗粒的计数（依据绝对计数浓度）（图1B）。

图1* 稀释的无血小板血浆样品 A） NanoSight技术生成的典型图像 所生成的图像让用户能够立即识别其样品的某些特性（包括浓度和多分散性水平）。 B） 样品的粒度分布与原始浓度计算值 *结果来源：C Gardiner¹, R Dragovic¹, A Brooks¹, D Tannetta¹, D Redman², P Harrison², and I Sargent¹（2010） Nanoparticle Tracking Analysis for the Measurement and Characterisation of Cellular Microvesicles and Nanovesicles, Proc NVTH BSTH 2010.
¹Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford
²Oxford Haemophilia & Thrombosis Centre, Churchill Hospital , Oxford, UK

替代技术

传统上，许多技术已被用来表征微米和纳米囊泡，同时有更多技术可用来分析微型颗粒。 其中包括：

• 流式细胞计数法
• 动态光散射（DLS）
• 电子显微镜检查法（EM）
• 酶联免疫吸附分析（ELISA）

上述技术中应用最广泛的是流式细胞计数法。 通常，商用流式细胞仪的实际粒度下限约为300 nm（对于聚苯乙烯颗粒）；在该数值下，信号无法与基线噪音区分开来。 虽然通过使用荧光标记可以扩展该检测限值，但粒度较小时，准确测定这类颗粒大小的能力严重受限。 DLS也已用于此项应用，并可为单分散样品提供精确的粒度信息。 NTA可以为需要高分辨率粒度分布的DLS提供其他正交信息。 电子显微镜检查法是一种非常有用的微米和纳米囊泡研究工具，但其代价是资金运行成本高、样品制备昂贵、处理时间长以及样品制备后的样品完整性差。

测定项目的可选择性

虽然它通常足以确定样品中是否存在某一粒度或粒度范围的颗粒，但它还具有鉴别和区分样品内特定的亚群落颗粒的附加价值。 NanoSight技术能够借助类似抗体介导型荧光标记等方法，选择性地分析这类群落。 这种方法使得用户可以只选择检测和分析结合有荧光标记型抗体的特异性纳米颗粒，而非特异性背景颗粒则通过使用适当的滤光器而被排除。 虽然可以使用一系列荧光团，但使用高效、高稳定性的量子点标记更具优势，可以取得最佳效果。

该技术如图2A所示，通过装有蓝紫色激光二极管（405 nm）的NanoSight 仪器激发的量子点的一个视频帧的荧光信号。 这些量子点用来标记对合胞体滋养层微泡（STBM）上的目标生物标记具有特异性的一种抗体（NDOG II）。

图2B显示出三种粒度分布，其中包括： i） （非荧光）光散射器检测到的STBM样品中的所有颗粒（蓝线）； ii） 在荧光模式下测定的结合有荧光量子点标记 NDOG II抗体的颗粒（红线）；和 iii） 一种对照品（绿线），由一个类似的量子点标记抗体组成，但抗体对STBM上的目标生物标记没有亲和力（同样在荧光模式下测定）。 这说明，样品中的大多数颗粒都成功使用STBM特异性量子点NDOG II抗体进行了特异性标记，并且对照品也成功显示出超低的背景信号。

图2* A） 借助抗体与STBM颗粒相结合的量子点所得出的荧光图像 B） 来自散射光（蓝色）、正确抗体（红色）和非正确（对照）抗体（绿色）的粒度分布 请注意计数浓度纵轴。

结论

NTA能够对低浓度的微囊泡和外泌体进行大小和浓度测定，并且在与荧光标记联合使用时，可以选择性地确定和分析复杂样品中特定类型的颗粒。