结构生物学家的一周生活
在结构生物学中，纯净的蛋白质只是拼图的一部分。确保最佳的蛋白质稳定性需要结合多种分析技术，以全面了解样品的质量。
这个案例研究跟随我们的一位结构生物学客户在一个项目中，该项目中他纯化的蛋白质被发现具有显著的不稳定性，并展示了如何通过结合 ITC、DLS、DSF 和 DSC 的多技术生物物理方法，揭示传统方法未能发现的不稳定性问题。
第1天
戴夫是一位正在表征新蛋白质靶标的结构生物学家。他通过建立一个纯化过程开始了他的项目，经过几个月的努力，他生产出可用量的蛋白质。尺寸排阻色谱（SEC）显示一个大的单体峰，SDS-PAGE 显示在正确的质量位置有一个清晰的条带，MALDI-ToF 分析确认了质量。
在进行 X 射线晶体学之前，戴夫设置了一种基于酶的检测，以确保蛋白质的活性—结果发现结果不一致且变化很大。
为了确定问题出在哪里，是蛋白质本身的问题，抑制剂，底物，还是检测中的其他组件，戴夫在同事的建议下决定使用等温滴定量热法（ITC）进一步探讨问题。他为过夜透析准备了样品，并在第二天早上回到了实验室。
观看这个简短视频，了解更多关于等温滴定量热法的原理。
第2天
第二天，戴夫在 Microcal PEAQ-ITC 上进行了 ITC 滴定，结果与教科书示例大相径庭（图1，左）。数据显示信号弱，结合参数中误差大，化学计量值远低于1（图1，右）。这明显表明，大部分蛋白质不能与配体结合有效，样品质量而非检测设计是变化性的来源。
第3天
为了了解他的蛋白质样品的物理属性，戴夫随后在 Zetasizer Advance 上使用动态光散射（DLS）。这证实了蛋白质聚集材料的存在（图2）。看起来蛋白质对在纯化过程中应用的浓缩步骤的条件敏感，导致了SEC无法直接检测到的聚集。
第4天
由于聚集被确定为关键问题，戴夫旨在通过筛选一系列缓冲液来优化他的蛋白质的稳定性，以帮助识别改善蛋白质稳定性的条件。
戴夫从差示扫描荧光法（DSF）筛选开始，评估多个缓冲液条件下蛋白质的热稳定性。然而，他当前的仪器不适合这种工作流程，因为该单元严格依赖外在荧光染料，该染料与蛋白质的疏水口袋结合—主动改变其稳定性，引入高风险的假阳性或淬灭信号。
尽管筛选标记了缓冲液3号作为潜在候选者，戴夫不能信任数据。这个笨拙的外在方法没有提供快速、省心的答案，而是迫使他寻找一种正交技术来验证结果，这违背了高通量筛选的目的。为了用不含染料、不含标签的技术确认DSF结果，戴夫在 MicroCal PEAQ-DSC 上运行一次有针对性的差示扫描量热实验。
与基于荧光的方法不同，DSC直接测量蛋白质在热展开期间的热容量变化，提供一个热量信号。它还不需要标签或染料，消除了在DSF步骤中引入的测量伪影的风险。
PEAQ-DSC数据证实了DSF结果：缓冲液3号表现出明显的正向移位，表观Tm提高22°C（图3，绿色曲线）。戴夫现在拥有独立的、定量的确认，缓冲液3号稳定了他的蛋白质。
随着重新配制的蛋白质样品，戴夫在PEAQ-ITC上观察到显著改善的结果，化学计量值为N=1，确认了缓冲优化（图4）。蛋白质现在能够与配体完全结合。
拥有一个稳定且经过验证的蛋白质样品，戴夫重新进行酶活性检测。结果是一致且可重复的。
通过一次ITC实验，戴夫获取了蛋白质的结合化学计量、结合亲和力和焓，并且知道通过ITC成功通过的蛋白质-配体对在X射线晶体学中有更高的成功机会。使用ITC获得的结合热力学可以与结构信息关联。
戴夫继续进行结晶，随后通过X射线晶体学确定了自由蛋白质及其与目标配体复合物的结构。
完成他的项目后，戴夫回顾了导致成功结果的步骤，指出综合的分析技术组合使他从无法解释的检测失败走到了结构和生化表征的蛋白质。
当他总结这一周的可消耗品库存时，戴夫思考着每一种技术需要不同的样品形式、不同的准备协议和不同的一套可消耗品。多方法方法的科学价值是显而易见的，但为每次分析使用不同仪器而带来的操作开销也是相当大的。
从这一周的学习中，戴夫认识到一个正交且互补的生物物理工具箱对于生成可靠、可靠的结果是必要的。他意识到每种技术都提供了拼图的一部分，结合起来，形成了完整的画面。若要提高下一个项目的工作流程，他将专注于更高的通量，更低的消耗品成本和更高质量的数据：这些结合使快速且自信地做出正确的决策成为可能。
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了解更多关于 ITC 如何在药物发现和开发中使用的信息，请参阅我们的海报。
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