差示扫描荧光法 (DSF)
快速洞察蛋白质稳定性、制剂及生物分子相互作用
快速洞察蛋白质稳定性、制剂及生物分子相互作用
差示扫描荧光法 (DSF) 是一种快速生物物理技术，通过追踪样品在受控热应力下荧光的变化来评估蛋白质的构象稳定性。随着温度升高，热能会破坏蛋白质的天然三维结构，暴露出此前隐藏在疏水核心内部的区域。
在传统的外源性 DSF 中，这种结构去折叠通过外部报告染料检测，这些染料会结合到新暴露的疏水区域。无标记的内源性 DSF 则依赖于蛋白质中芳香族氨基酸（如色氨酸）的天然荧光。当样品发生去折叠时，芳香族氨基酸从埋藏的非极性环境转变到暴露的极性环境，从而改变蛋白质的天然荧光发射光谱。
内源性差示扫描荧光法依赖于氨基酸色氨酸，色氨酸在 280 nm 处吸收紫外光，并在 300 nm 至 400 nm 之间发射荧光。
在天然折叠的蛋白质中，色氨酸残基通常位于疏水核心内，其荧光发射峰值约在 330 nm。当热应力迫使蛋白质去折叠时，这些原本埋藏的残基暴露于周围的极性水环境中，导致发射光谱向 350 nm 移动。
通过在受控温度梯度下记录这两个发射波长的比值 (F350/F330)，系统会绘制出一条 S 形热去折叠曲线。对该曲线进行数学分析，可确定去折叠起始温度 (Ton) 和中点熔解温度 (Tm)，即 50% 蛋白质群体发生去折叠时的温度。
由于较高的 Tm 反映出对热诱导变性具有更强的抵抗能力，DSF 使研究人员能够快速对候选分子进行排序、筛选缓冲液条件，并在整个药物开发管线中评估候选分子的稳定性。
此外，当与光散射方法（如静态光散射或动态光散射）结合使用时，内源性 DSF 有助于区分构象去折叠和物理聚集，从而提供蛋白质在溶液中的全面稳定性图谱。
差示扫描荧光法 (DSF) 通过监测温度升高过程中的构象变化来测定蛋白质热稳定性。外源性和内源性 DSF 的区别在于是否添加了报告染料。
| 功能 | 外源性 DSF | 内源性 DSF |
|---|---|---|
| 机制 | 使用添加的荧光染料（例如，SYPRO Orange），该染料在去折叠过程中与暴露的疏水区域结合。 | 无标记技术，追踪芳香族氨基酸 (Trp/Tyr) 的天然荧光变化。 |
| 样品制备 | 需要添加燃料和优化染料。 | 无需标记；可在蛋白质的天然缓冲液中直接测量。 |
外源性 DSF 的局限性：
内源性 DSF 的局限性：
下一代高通量生物物理筛选技术
