GPCR 的结合动力学

简介

G 蛋白偶联受体 (GPCR) 是一类完整的膜蛋白，在细胞外刺激跨细胞膜传递以引发分子和细胞反应方面起着至关重要的作用。它们在真核生物中调节多种生理过程，代表了最大的治疗靶点，超过 30% 的现有药物针对 GPCR。

众所周知，膜蛋白难以进行研究，因为需要模拟膜的环境，并且一旦从细胞膜中提取出来，它们就极不稳定。在此，我们展示了 Creoptix WAVE 在最高分辨率下测量肽配体激动剂 (NTA11) 与神经降压素受体 1 (NTSR1)¹ 的热稳定变体相互作用的能力。GPCR 介导神经降压素的多种功能，如低血压、高血糖、低体温、镇痛作用和调节肠运动和分泌 ²。

材料和方法

受体通过 avi 标签在体内发生生物素化，并被链霉亲和素预包被传感器 (WAVEchip DXH-STA) 捕获。对于所测得的肽激动剂，使用突变和截断形式的神经降压素 (MW725DA)，包括用 Y11A 取代的 8-13 残基。在系列稀释 3 倍下，记录了 7 种不同分析物浓度的剂量-反应曲线，最高浓度为 300 nM。流速设为 30 μL/分钟。运行缓冲液为 5 0 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、0.1% (w/v) 去垢剂月桂基麦芽糖新戊二醇 (L-MNG) ³。所有测量均在 25°C 下进行。

结果

在链霉亲和素预包被传感器 (WAVEchip DXH-STA)（密度为 1350 pg/mm²）上捕获纯化的和生物素化的神经降压素受体。记录了肽激动剂结合的剂量-反应曲线（图 1），产生的结合数据可以很好地符合 1:1 相互作用模型，包括质量传输项 (MTL)。得到的动力学速率和平衡常数总结见表 1。

图 1：作为分析物的修饰神经降压素肽（分子量 725 Da）和作为配体的热稳定神经降压素受体（NTSR1，70 kDa 蛋白质/去垢剂复合物）之间相互作用的传感图。使用 WAVEcontrol 软件利用 1:1 相互作用模型对数据进行拟合，包括质量传输限制 (MTL) 项

表 1：通过 1:1 相互作用模型获得的 NTA11 激动剂的动力学速率和解离常数（包括质量传输限制项 [MTL]）

参考文献

1. Egloff, P., Hillenbrand, M., Klenk, C., Batyuk, A., Heine, P., Balada, S., Schlinkmann, K. M., Scott, D. J., Schütz, M., and Plückthun, A. (2014) Structure of signaling-competent neurotensin receptor 1 obtained by directed evolution in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.U. S. A. 111, E655–62.
2. Krumm, B. E., and Grisshammer, R. (2015) Peptide ligand recognition by G protein-coupled receptors.Front.Pharmacol. 
3. Chae, P. S., Rasmussen, S. G. F., Rana, R. R., Gotfryd, K., Chandra, R., Goren, M. a, Kruse, A. C., Nurva, S., Loland, C. J., Pierre, Y., Drew, D., Popot, J., Picot, D., Fox, B. G., Guan, L., Gether, U., Byrne, B., Kobilka, B., and Gellman, S. H. (2010) Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization,  stabilization and crystallization of membrane proteins.Nat. Methods 7, 1003–1008.