蛋白质的热展开：原理、方法与应用 – 什么是热展开？
热展开是指蛋白质在温度驱动下失去其天然三维结构。随着热能增加，稳定折叠态的非共价相互作用——氢键、疏水堆积、范德华接触——会逐步被破坏，蛋白质从有序、致密的构象转变为无序或部分有序状态。
这一转变通常以熔解温度（Tm）来表征：即折叠态与展开态群体各占一半时的温度。Tm并不是蛋白质在孤立状态下的固定物理常数——它取决于溶液条件、缓冲液组成，以及配体或辅料的存在——而这恰恰使它具有实用价值。比较不同条件或不同变体下的Tm，可以定量、可重复地衡量相对热稳定性。这种对环境的依赖并不局限于试管内：Leuenberger及其同事开展的全细胞热分析研究，在完整细胞内同时追踪数千种蛋白质的展开，表明热稳定性与结构和生物学特征相关，例如蛋白质大小、四级结构以及聚集倾向，而不仅仅由氨基酸序列决定。¹ 换句话说，热稳定性反映的是蛋白质更广泛的结构背景，而不只是其孤立折叠本身——这也解释了为什么体外的Tm变化是如此有信息量、且可推广地反映底层结构敏感性。
较高的Tm通常意味着分子具有更高的热稳定性，而Tm的变化是最快速地观察突变、缓冲液、辅料或制剂条件如何影响蛋白质稳定性的方法之一。
在生物制药开发中，这一点尤为重要，因为热稳定性与蛋白质在真实世界压力下的行为密切相关：制造、运输或储存过程中的升温；冻融循环；或者货架期中简单的温度暴露。较低或发生偏移的Tm是一个早期信号，提示该分子可能更容易受到这些压力的影响。
展开也在机制上与下游风险相关。随着蛋白质失去天然结构，原本埋藏的疏水残基会暴露于溶剂中。这些暴露表面是蛋白质-蛋白质缔合的主要驱动力，使部分或完全展开的物种更容易发生聚集。反过来，聚集又与生物活性下降、药代动力学改变以及——在生物制剂中——免疫原性风险相关。因此，热展开很少是人们单独关注的终点；它是结构不稳定性的替代指标，而这种不稳定性会先于这些下游失效模式出现，这也是为什么Llowarch等人将热转变描述为早期药物发现中最敏感、应用最广泛的蛋白质稳定性读出之一。²
如何测量热展开？
差示扫描量热法（DSC）和差示扫描荧光法（DSF）是测量热展开最常用的两种技术，它们探测的是根本不同的物理性质。
DSC直接测量热量。展开是吸热过程，因此会表现为热容峰值；从中无需依赖报告分子或预设的光谱模型，就可以提取Tm、展开焓（ΔH）以及热容变化（ΔCp）。这使DSC成为一种不依赖模型、热力学上直接的测量方法——也是其他方法通常据以验证的参考技术。
DSF则是光学且间接的：它跟踪的是随着结构丧失而变化的荧光信号。常规DSF使用外源染料，该染料会在展开时结合暴露的疏水表面。内源DSF作为一种完全无需标记的技术，则在加热蛋白质时跟踪色氨酸和酪氨酸残基的内源荧光。随着这些残基在展开过程中变得更暴露于溶剂，其发射光谱会发生位移，而将这种变化与温度作图即可得到起始温度和Tm。
这两者并不能互换。NIST的直接比较发现，DSC和DSF测得的Tm值常常一致，但并非总是如此。结果取决于扫描速率，而方法选择也会显著改变所获得的转变温度——这提醒我们，“如何测量”和“测量什么”同样重要。³ 因为展开过程通常更多受动力学而非纯热力学控制。³
这就是为什么这些技术是互补而非可替代的：DSC提供热力学深度，DSF提供通量。将DSF用于早期广泛筛选，并用DSC确认和表征筛选出的候选物，可以弥补各自的主要局限——这也反映了当前药物发现中的实践：位移分析作为主要筛选手段，而量热方法提供正交确认。² DSC和DSF报告的是构象，而不是蛋白质开始展开之后发生了什么。动态光散射（DLS）则弥补了这一空白：DLS通过分析散射光的波动来测量溶液中颗粒的尺寸，因此对更高级别物种——二聚体、寡聚体以及更大聚集体——在样品加热时的出现极为敏感。与 DSF 或 DSC 一同进行热升温实验时，SLS 可揭示蛋白质聚集起始温度（Tagg），同时结合 DLS 检测到的流体动力学半径变化，显示蛋白质展开事件之后是否发生了自我缔合。
DLS和SLS：补全全貌
静态光散射（SLS）又增加了一层热力学信息。通过散射强度对浓度的依赖关系，SLS可直接获得第二维里系数B22——这是蛋白质-蛋白质净相互作用的度量。与传统上仅由DLS推导出的扩散相互作用参数kD相比，这是一种更严格的读出：kD具有经验性，并且会把真实热力学相互作用与水动力和摩擦效应混合在一起，有时甚至会扭曲或反转表观相互作用的符号。B22不受这些水动力伪影影响，因此是胶体稳定性、溶解性和聚集倾向更直接、更可靠的预测指标。
将构象分析（DSF或DSC）、尺寸分析（DLS）和热力学相互作用分析（SLS）结合起来，就能把一次热扫描转化为完整图景——不仅知道蛋白质何时展开，还能知道它是否、以多大强度、以及在什么条件下继续发生自缔合。
为什么要将DSF与高通量DLS/SLS结合？
展开和聚集彼此相关，但并不是同一事件，而且它们并不总是同步发生。一个分子在构象上可以非常稳定，却仍然因为胶体不稳定性而在中等温度下聚集；相反，一个分子也可能在相对较低的Tm下展开，但并不会立刻形成可见聚集体。只测其中一种，可能会完全漏掉另一种失效模式。
这正是药物发现文献中关于热位移方法所强调的观点：由于这些分析建立在温度与蛋白质折叠/展开平衡之间的简单物理联系之上，因此当它们与正交检测方法结合、用以确认这种移动的平衡对样品到底产生了什么影响时，信息价值最高。⁴ 在同一块板上、沿同一热梯度对同一样品同时运行DSF和DLS/SLS，意味着每一个Tm值都可以用来自相同样品和相同加热曲线的Tagg值进行核对——无需第二次实验，无需单独分装，也无需担心不同分析之间的差异其实只是样品制备差异。
这种效率优势与科学价值同样重要。与其分别开展一次DSC实验、一次单独的DSF筛选，然后再进行DLS/SLS稳定性研究，不如采用整合的DSF/DLS/SLS流程，一次即可获得构象和胶体数据。对于制剂筛选和稳定性评估——需要比较数十种缓冲液、pH和辅料组合时——这种整合既节省样品，也节省时间，同时不牺牲数据集的深度和质量。
高通量分析的优势
高通量并不仅仅意味着更快；它改变了你能提出什么样的问题。基于微孔板的高通量DSF/DLS/SLS流程允许你在相同条件下、同一轮实验中并行比较数十种制剂、缓冲液或候选分子。
这种广度在开发早期最为重要，因为此时目标不是完整表征单一分子，而是比较多个分子并进行排序。在这一阶段生成稳健、可比的数据集——而不是只对少数条件获得深入但狭窄的数据——能为制剂和候选筛选团队提供更有力的决策依据。更快的筛选意味着更早作出决策，把更少资源浪费在那些本就不可能成功的候选物或条件上。最终效果正是所有生物制剂项目都在追求的：更短的开发周期，以及把材料和仪器时间用在最关键的地方。
在生物制剂中的应用
制剂开发。 将辅料、缓冲液、pH和离子强度与Tm和Tagg并行筛选，可以帮助制剂开发人员快速找到既能防止展开又能抑制聚集的条件，而不只是其中之一。
候选筛选。 当存在多个候选变体或突变体时，热稳定性分析是对它们进行排序最快的方法之一，可快速识别哪些候选物最不可能在后续制造或稳定性方面带来麻烦。
稳定性研究。 稳定性研究将展开和聚集行为结合起来，以建立分子在热应激下的风险画像。跨候选制剂或储存条件跟踪Tonset、Tm、Tagg和B22，不仅能显示蛋白质从何处开始失去结构，还能显示这种结构丧失是否会转化为自缔合——这正是及早发现易聚集条件所需的组合，避免其在后续开发阶段才暴露出来。
更少投入，更多洞察。 在这三种应用场景中，将高通量内源DSF与高通量DLS/SLS配对的吸引力是相同的：以更少样品和更短时间生成更丰富、相关性更好的数据，而不必分别运行等效技术。
结论
热展开是研究蛋白质稳定性最具信息量的方法之一——但前提是你要看到全貌。将内源DSF与高通量DLS结合，可以在同一样品、同一热扫描中并排捕捉构象变化和聚集行为。实际收益很直接：更低的样品消耗、更快的制剂或候选物筛选，以及对制剂或分子筛选决策背后稳定性数据更高的信心。
参考文献
- Leuenberger P, Ganscha S, Kahraman A, et al. Cell-wide analysis of protein thermal unfolding reveals determinants of thermostability. Science. 2017;355(6327):eaai7825. https://www.science.org/doi/10.1126/science.aai7825
- Llowarch P, Usselmann L, Ivanov D, Holdgate GA. Thermal unfolding methods in drug discovery. Biophysics Reviews. 2023;4(2):021305. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10903397/
- Lang BE, Cole KD. Measurement of the Thermal Unfolding of Proteins by Differential Scanning Calorimetry and Fluorescent Reporter Dyes. National Institute of Standards and Technology. https://www.nist.gov/publications/measurement-thermal-unfolding-proteins-differential-scanning-calorimetry-and
- Thompson A. Employing thermal protein unfolding to search for new drugs. Scilight. 2023;2023(20):201108. https://pubs.aip.org/aip/sci/article/2023/20/201108/2890803/Employing-thermal-protein-unfolding-to-search-for
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