扩散屏障法 – 实用细节

如何采用扩散屏障法进行电位测量？

扩散屏障法特别适用于低样品量和高离子强度缓冲液。此方法包括小心地将“样品塞”注入已经只包含缓冲液的折叠毛细管电池中。（该缓冲液必须与蛋白质制备的缓冲液相同，具有相同的电导率、相同的pH和相同的添加剂，以便尽可能接近样品和扩散屏障）。在此设置中，主要关注的是电位，不过尺寸也可以测定。

实用细节在“扩散屏障技术，实用方面和数据解释”中有讨论，网络演示的录音“使用Malvern新扩散屏障法进行蛋白质电位测量”中也有提到，以及应用说明 “用于准确和可再现的蛋白质移动性测量的扩散屏障技术”中也有介绍。 以下是该方法的关键组件的实用概述的简要总结。

为什么考虑这个扩散屏障法？

您可能希望考虑该方法的两个主要原因。这两者都是由于样品的原因。

1. 低样品可用性。如果您只有非常有限的样品数量，那么此方法可以允许在仅含样品的部分单元中进行测量。 （其余的单元含有缓冲液）。
2. 保护样品免受电极相互作用。在某些条件下（如高离子强度，某些磷酸盐，一些含硫缓冲液成分）可能会发生电极发黑（降解）。虽然发黑本身并不一定是坏事，但它是样品与电极潜在相互作用的指示。

其他影响包括焦耳热、样品降解（聚合）和电极极化。使用扩散屏障法可以帮助将这些不利影响最小化。

如何引入样品？

样品被轻轻注入已经充满缓冲液的DTS1070毛细管电池 中，使用凝胶加载尖端。我们测试了Costar移液管尖端(1-200µl，圆形，0.5mm厚，Sigma cat:4853)，类似的尖端应能很好地工作。使用时，轻轻将凝胶加载尖端推入毛细管电池的一个加载口，直到您感觉到一个“自然”的终点，然后先注入70µl（这种情况下您不会因塞位置出错）。随着您对这种方法的熟悉，您可以轻松地将注射量减少到50µl，最终甚至减少到20µl。您可以通过蓝色右旋糖酐溶液练习，或者通过软件中的计数速率监视器（工具 – 计数速率计）确认散射量在样品塞内。

在软件中选择哪些设置？

您应该选择特殊的仪器设置，以便能够在具有相对高离子强度的缓冲液中测量蛋白质样品的电位。电位分析软件中的自动模式将降低施加的电压。但对于最温和的样品处理，您可以根据应用说明中的表格手动调整分析设置。

要在手动或SOP设置期间访问这些设置，请转到：

• 测量 -> 测量持续时间 -> 自动 -> 最大运行次数
  将最小值留在10，根据表格选择最大值
• 测量 -> 测量 -> 测量之间的延迟（秒）
  在重复测量时，最好让样品休息30秒
• 测量 -> 高级 -> 电压 -> 自动电压选择 -> 否
  根据表格输入建议的电压

之前

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