最佳实践：蛋白质和生物聚合物的微分扫描量热法

在之前的博客中，我讨论了使用 MicroCal DSC 获得高质量数据的最佳实践。这里是关于MicroCal PEAQ-DSC系统以及 MicroCal VP-Capillary DSC 和 VP-DSC 系统的更多最佳实践。这些最佳实践适用于分析溶液中的蛋白质及其他生物聚合物。

样品要求：

• 为了获得高质量的微分扫描量热法（DSC）数据，样品需要在所需的缓冲液（pH值、盐、辅助物等）中，匹配的缓冲液用于 DSC 的参考池和缓冲液-缓冲液扫描。
• 通过透析、去盐柱或其他缓冲液交换方法在所需的缓冲液中制备样品。
• 保存透析/缓冲液交换中的缓冲液用于参考池、缓冲液-缓冲液扫描和样品稀释。
• 推荐的蛋白质浓度范围是 0.1 mg/ml 到 2 mg/ml。
• 来自 DSC 的 T_m 可以是浓度依赖性的。
  • 对于 T_m 筛选和可比性/相似性研究，确保所有蛋白质的浓度相匹配。

DSC 设置：

• 在使用 DSC 进行 T_m 筛选和可比性/相似性研究时，确保所有设置相同，包括扫描速率、温度范围、反馈模式、预扫描恒温。
  • T_m 和 DSC 热图可以依赖于扫描速率和反馈模式。
• 温度范围：扫描从第一个 T_m 之前的 10-20°C 开始，到最后一个 T_m 之后的10-20°C 结束。
• 扫描速率：
  • 蛋白质和核酸的典型扫描速率为 60 到 90 °C/h
  • 脂质的典型扫描速率为 30 到 60°C/h
  • 对于 MicroCal PEAQ-DSC 和 VP-Capillary DSC，在 T_m 筛选期间使用 180 到 240 °C/h 的扫描速率以提高样品通量
• 推荐的“反馈模式”：
  • 蛋白质 – 无或低
  • DNA 和 RNA – 低或中等
  • 脂质 – 高
• 推荐的“预扫描恒温”时间为 3 到 15 分钟。

对于自动化的 MicroCal PEAQ-DSC 和 VP-Capillary DSC 系统：

• 确保样品在 DSC 分析前存储于适当的温度。对于蛋白质和其他生物分子，将冷却堆温度设置为 5 到 10°C。如果您正在研究耐热材料，可以将冷却堆设置为 25°C。
• 使用至少三次清洗补充（在 VP-Capillary DSC 中称为“填充行程数量”）从 96 孔板中填充 DSC 细胞。
• 使用 20% 的 Contrad 70 或 14% 的 Decon 90 程序设定细胞清洗。

DSC 原始数据质量：

• 始终有一个匹配的缓冲液-缓冲液扫描（在相同的扫描条件下运行）用于数据分析。如需要，可以在每个样品前执行一个缓冲液-缓冲液扫描。
• 频繁的缓冲液-缓冲液扫描作为额外的仪器性能检查，以确保 DSC 细胞清洁，仪器正常运行。
• 整个序列中的缓冲液-缓冲液扫描应该是可重复的（假设使用相同的 DSC 运行参数）。
• 对于自动化 PEAQ-DSC，及其高效的清洗泵和优化的 DSC 细胞清洗协议，可以连续运行三个（或更多）样品，而无需在其间运行缓冲液-缓冲液扫描。
• 原始 DSC 热图的 DP 值（以 mcal/min 为单位）在缓冲液-缓冲液或水-水扫描开始时应接近于零。
• 在蛋白质扫描的开始，DP 值通常会变得更负，与匹配的缓冲液-缓冲液扫描相比。较高的蛋白质浓度有更大的负偏折。在缓冲液良好匹配的情况下，该 DP 差值应约为每 1 g/L 蛋白 0.15 至 0.25 mcal/min（图 1）。
• 如果蛋白质与缓冲液-缓冲液扫描之间的 DP 差值大于 1 mcal/min，可能是由于蛋白质与缓冲液不匹配、细胞脏、细胞填充不足、细胞中有气泡或蛋白质更集中造成的（图 2）。

图 1.

图 2.

观看此视频，解释什么是微分扫描量热法

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