为样品选择最佳GPC/SEC色谱柱组合

如果您曾经使用GPC/SEC（如OMNISEC）进行过工作，您会知道所有的分析都依赖于色谱柱组合的配置。有时为应用领域选择合适的色谱柱可能是困难的。有时，对于不同类型的样品，可能需要完全新的色谱柱组合配置。

选择与样品最匹配的色谱柱组合时，有多个因素需要考虑。您需要考虑分子尺寸/重量范围、溶解样品时所用的流动相与色谱柱的兼容性、样品中的官能团与色谱固定相的兼容性等。如果使用多个色谱柱，还需考虑它们是否相互补充以及连接顺序。

这篇文章将提供关于色谱柱的一般信息，并提供有关如何为样品创建合适的色谱柱组合的见解。这里的信息主要与从分子尺寸/重量范围视角选择最佳色谱组合有关。有关可用于多种流动相分析的色谱柱信息，请参阅这里的链接文章和网络研讨会。

色谱柱组合中会发生什么？

我们从简要概述GPC/SEC色谱柱组合中分离的工作原理开始。正如上图所示，不同尺寸的两种样品的溶解混合物被引入色谱柱中。随着时间的推移，这两个样品组分和溶解溶剂以不同速度通过色谱柱。最大的样品首先洗脱（群体2），然后是较小样品（群体1），最后是溶解溶剂洗脱。

理解分离是基于分子的尺寸而不是分子量是很重要的！

这种分离之所以会发生是因为色谱柱的固定相是由具有孔隙的凝胶颗粒组成的。这些孔足够大，样品分子在通过色谱柱时可以扩散到孔内。小分子更容易扩散入孔，因此与中、大分子相比，花费更多时间在孔中。最大的分子不容易扩散到孔内，因此它通过色谱柱的路径更简单、更快。

使用GPC/SEC，分离是基于分子尺寸进行的，较大的分子首先洗脱，然后是中等分子，最后是小分子。请参阅下面的动画描述以了解该过程。大的三角形不花费大量时间来扩散到孔中，先被洗脱，接着是中等的矩形，最后是小的圆形，它们可以更容易地移动到孔内。

混合床层和单一孔径色谱柱

这两种类型色谱柱的区别在这篇文章中有详细说明。简单总结一下，混合床层色谱柱含有粒子和孔径混合的固定相凝胶，能够在广泛的分子尺寸/重量范围内提供分辨率。单一孔径色谱柱含有均质的固定相凝胶，能够在相对较窄的分子尺寸/重量范围内提供卓越的分辨率。

如何组合色谱柱以形成色谱柱组合

要为样品创建优化的色谱柱组合，您可能需要结合多于一个的色谱柱。（不过，如果一个色谱柱就能为样品提供足够的分辨率并且是所需的全部，则不需组合色谱柱。）这可以节省时间和流动相。这通常适用于蛋白质样品。蛋白质的分子量覆盖广泛的范围，但由于折叠的结构，蛋白质样品的尺寸范围比聚合物的尺寸范围要窄。

有三种常见的方法用于组合色谱柱以形成一套。在这里，我们只是建议这些方法，但并不是全部。

两个混合床层色谱柱：这是最常见的通用色谱柱组合，包括有机色谱柱、水基色谱柱和特种色谱柱。明确地说，我们将使用相同的混合床色谱柱。例如，分析多糖样品时，通常使用两个A6000M色谱柱，它们是水相分析用的混合床层色谱柱。像这样使用两个混合床层色谱柱会倾向于最大化分子尺寸/重量范围，同时保持运行时间在大约45分钟以下，达到最佳的点。

高/低MW色谱柱与混合床层色谱柱组合：在特别存在高分子尺寸/重量或低分子尺寸/重量的样品中，如聚集体或低聚物，我们建议在单一混合床柱中增加一个高/低单一孔径色谱柱。高/低分子量单一孔径色谱柱确保样品在分子尺寸连续体的一个极端上具有的特定特征足够分辨率，而混合床层色谱柱则涵盖剩余的样品物质。如果想提高样品峰和溶剂峰之间的分辨率，可以在混合床色谱柱中添加一个低分子量色谱柱。

多个单一孔径色谱柱组合：这种策略适用于已经知道不需要混合床层色谱柱提供的全面分子尺寸/重量范围分辨率的情况。这种类型的色谱柱组合在监控类似样本的环境中（如QC）可能是有益的。优点是在与样品相关的分子尺寸/重量上获得最高的分辨率。也可以结合两个或更多的单一孔径色谱柱以涵盖广泛的分子尺寸/重量范围，如T5000 + T3000 + T1000。在这个例子中，分析时间虽然延长了，但分辨率得到了提高。

在组合单一孔径色谱柱时，确保它们不彼此远离。这有助于防止在分辨率范围上出现间隙。重温上述使用三个单一孔径色谱柱的示例，仅仅结合T5000 + T1000是不推荐的。由于分辨率范围之间的差异，可能会生成如下面所示的洗脱剖面，这会在非样品的情况下导致数据中出现异常峰形和伪影。

色谱柱的顺序

许多人都会问“在组合色谱柱时应按何种顺序连接它们？”

我们建议一个合理的顺序是从最高分子尺寸/重量的色谱柱开始，然后依次向下排列。这样，整个样品混合物在首次引入色谱柱组合时，最大的分子就可以开始分离。如果以低顺序排列色谱柱，最大分子可能不得不通过小分子尺寸/重量色谱柱，从而可能干扰较小分子扩散进入孔隙。

因此，以上示例中我们使用的是T5000 + T3000 + T1000柱。在将单一孔径色谱柱与混合床层色谱柱组合时，在混合床柱前加入高分子尺寸/重量的单一孔径色谱柱，在混合床柱后加入低分子尺寸/重量的单一孔径色谱柱。