Malvern MicroCal Auto-iTC200 在基于片段的药物发现活动中的多种应用

简介

本报告概述了基于片段的药物发现 (FBDD) 方法，该方法可用于鉴定和优化可抑制磷脂酰肌醇3-激酶 (Vps34) 活性的先导化合物。 该激酶已被发现在针对抗癌药物的耐药作用中扮演重要角色 (1,2)。 Vps34 对自体吞噬激活极为重要，并被视作治疗性干预的靶标。 自噬，或自体吞噬，是涉及细胞成分通过溶酶体机制降解的分解过程，被视作重要的致癌机理。

MicroCal Auto-iTC200 在这个研发活动中起到至关重要的作用，主要是因为制备靶蛋白的步骤非常少，且分析设计简单。 MicroCal Auto-iTC200 数据用于验证基于热转移初筛得出的靶点，并准确地对片段的亲和力排序，以保证只有结合力最强的候选物可进入共结晶实验和基于结构的药物研发程序。 通过等温滴定量热法 (ITC) 验证选择的 14 种蛋白质复合物中有 12 种成功结晶，证明此方法能够成功预测可与靶标形成共结晶复合物的靶点。 该仪器还可用于评估基于结构的药物化学项目中后续优化研发过程成功与否。

图 1. FBDD 活动工作流程概览 使用热转移分析筛选片段库。 使用 MicroCal Auto-iTC200 验证最终得到的片段靶点。 使用 MicroCal VP-Capillary DSC 分析和验证靶蛋白的热稳定性和靶点的稳定作用。 ITC 确认的靶点发生共结晶。 优化周期包括：药物化学、使用 MicroCal Auto-iTC200 进行靶点表征、以及共结晶，由此产生一组化学序列。 DSC 用于表征靶蛋白的稳定性以及验证一些热转移数据。

材料和方法

蛋白质和片段由 Sprint Bioscience（瑞典斯德哥尔摩）提供。 MicroCal Auto-iTC200 和 MicroCal VP-Capillary DSC 可从 Malvern Instruments 获得。 所有实验均在 25°C 条件下进行。

MicroCal Auto-iTC200 样品池注入 pH 为 7.5 的 20 mM 三羟甲基氨基甲烷、300 mM NaCl、10% 丙三醇、0.5 mM TCEP 和 2% 或 5% DMSO。 被视作弱结合物 (K_D > 10 µM)的片段是在 4 mM 的浓度下，注入到浓度为 50 µM 的蛋白质溶液中。 较强的结合物是在 200 µM 的浓度下，注入到浓度为 20 µM 的蛋白质溶液中。 注入量为每次 3 µl，注射 12 次，注入时间为 6s，每次注射之间间隔 150s。 每个实验总计约需要 20 分钟。 片段的分子量范围是 149 Da 至 333 Da。 MicroCal VP-Capillary DSC 用于评估在存在和不存在所选片段的情况下检测缓冲液中靶蛋白的热稳定性。 在 DSC 扫描中，蛋白质浓度为 0.2 mg/ml，片段浓度为 1 mM。 扫描速率为 60°C/h。

初筛

使用热转移方法通过 Vps34 筛选约有 500 个片段的库，蛋白质在有和无各片段（浓度为 1 mM）的情况下进行加热。 使用差示扫描荧光法 (DSF) 检测蛋白质变性过程。 目的是找到可以成功共结晶的粘结剂，以便为先导物生成和优化过程收集结构信息。

MicroCal Auto-iTC200 尤其适合此项目，因为蛋白质具有不稳定性，而这一难题在尝试研发需要蛋白质固定化的结合检测法时变得明显。 选择 ITC 作为靶点验证的方法主要是因为其需要的准备步骤很少，从而降低了蛋白质降解的风险。 使用 MicroCal AutoiTC200 可以在含有丙三醇的粘性缓冲液中轻松、快速地进行分析。 使用 MicroCal VP-Capillary DSC 进行蛋白质稳定性的基本表征时发现轻微的热稳定性问题（Tm=50°C，检测缓冲液带有 4% DMSO）。 DSC 确认了通过热转移检测得出的两个片段靶点的稳定作用。 在此研究过程中鉴定的片段之一已通过 ITC 确认为粘结剂，并产生了共结晶结构，但在 DSF 实验中发现其出现了负向转移。 在对该片段进行进一步表征期间，在 DSC 中测试时发现其可稳定靶蛋白。 这强调了热稳定性检测正交实验的重要性，以及在 DSF 初筛期间表现出负向转移的片段中鉴别出粘结剂的可能性。

从初筛中筛选出的靶点的后续分析在剂量反应热转移研究中进行（图 2）。 成功的热转移和 ITC 检测要求片段具有较高的溶解度。 剂量反应曲线中的下降表明靶点的溶解度有限，此类片段不进行进一步研究。 可生成剂量反应曲线的片段之后将使用 MicroCal Auto-iTC200 在二次检测中验证。

图 2. 两个热转移实验的剂量反应图示例。 以片段浓度为参数绘制 Tm 转移图。 片段 SB002-41 因溶解度有限在曲线上显示有所下降，因此不进行进一步研究。

通过 MicroCal Auto-iTC200 验证靶点

MicroCal Auto-iTC200 是靶点验证的首选方法，主要原因是其需要很少的蛋白质准备步骤，降低了蛋白质失活的风险。

等温滴定量热法可测定相互作用的分子从自由态变成束缚态时热能的改变。 通过测定得到的等温线经过相应的结合模型分析后可计算出亲和力 (K_D)、化学计量 (N) 和相互作用的焓 (ΔH)。 在本研究中，亲和力用于对片段进行排序，以选择最强的粘结剂进行结晶。

在从热转移筛选中筛选出的 47 个片段中，33 个具有良好的结合数据，可用于对亲和力定量，另外 14 个片段要么表现出无结合放热要么有不寻常的等温线（图 3）。 检验 MicroCal Auto-iTC200 原始数据可提前识别和消除热转移检测产生的靶点中的假阳性。 33 个有潜力的片段按亲和力排序，对 20 个最强的粘结剂再次进行筛选，以评估亲和力测定的可靠性。 尽管粘结剂较弱且使用了不同批次的蛋白质，但第一次和第二次筛选的数据仍具有较高的一致性（图 4）。

图 3. 使用 MicroCal Auto-iTC200 分析的片段示例。 左侧和中间的图显示了亲和力约为 (A) 0.9 mM 和 (B) 4 µM 的片段的原始数据（上半格）以及结合等温线（下半格）。 在这些化合物中选择最强的粘结剂进行进一步研究。 亲和力较低的片段 (A) 的数据代表了一个低 C 滴定设置的例子，其中浓度低于 K_D 的蛋白质被过量化合物滴定 (3)。 (C) 显示了因为等温线异常而被拒绝的片段的数据。 峰较宽，且在下次注射前不返回到基线。 这指示一种缓慢的活动，即缓慢的（配体诱导）聚合过程、或是缓慢的配体解离。 导致后一种行为的原因可能是注射器中的小分子在高浓度条件下聚合，然后在稀释时分解。 没有明显的结合迹象，且有一些异常行为，因此它可能在初筛中是假阳性。 (D) 显示的原始数据来自在前两次注射中出现放热行为并在后续注射中发生吸热行为的片段。 这种复杂的行为可能是假阳性导致，因此该化合物不用于进一步研究。

图 4. 测定片段亲和力的可靠性。 制作相同蛋白质进行两次测定的结果图以评估亲和力确定的再现性。

根据此数据，选择 14 个片段进行共结晶结构确定。 其中 12 个片段实验结果成功（图 5），表明 MicroCal Auto-iTC200 可用作测定蛋白质片段共结晶结构的有效预测工具，可筛选出可用于进一步化学研发的片段。

图 5. 与 Vps34 结合的片段的晶体结构。

先导物生成

通过二次筛选的 47 个靶点代表五种不同的化学序。 二次筛选中鉴定的最牢固的粘结剂源自其中两个序，这两个序在药物化学项目中进行了进一步优化。 化合物的下一个研发过程包括两个序的结构元素，并使用 MicroCal Auto-iTC200 验证与靶蛋白的结合（图 6）。 第二代片段明显改善了对靶蛋白的结合亲和力，证明 ITC 适合作为驱动结构-活性关系的检测方法。

图 6. 两个化学序与较牢固的粘结剂重组的示例。 ITC 测定显示下一个研发过程的亲和力有所改善。

结论

本文报告了 MicroCal Auto-iTC200 在基于片段的药物研发工作流程中的成功应用。 该仪器为药物研发提供了便利，所需分析方法制定和样品制备工作量少，支持流线型工作流程，提供一致、可靠的结果。 对于在其他正交实验中表现出有限稳定性的蛋白质，该仪器能作为二次筛选工具成功地用于靶点验证。 从该系统获得的数据可用于在初期识别和消除初筛产生的假阳性，且该方法还被证明是成功测定蛋白质片段共结晶结构的良好预测工具。

总而言之，ITC 是一种可提供 K_D 值的 SAR（结构-活性关系）检测法，该值可用于优化片段序和指导药物研发过程中片段的下个化学研发过程。 全自动 MicroCal Auto-iTC200 的设计具有易于使用和高度敏感性的特点，是非常有用的工具。

致谢

蛋白质材料和片段以及热转移检测和 X 射线研究的数据由 Sprint Bioscience 友情提供。

Sprint Bioscience 是一家药物研发公司，开展了多个创新性的肿瘤项目，专注于癌症代谢研究。 通过使用基于片段的药物研发平台，Sprint Bioscience 可以快速识别适合药物研发的分子。 这些分子是药物研发项目的基础。 在涉及蛋白质科学、片段筛选、医疗化学、X 射线晶体学和相关生物学研究的研发过程中，Sprint Bioscience 改造分子，以便制造适合进入研发过程的候选药物。 此外，Sprint Bioscience 提供合同研究服务，通过该服务可使用其内部知识与技术平台。

参考文献：

1. Funderburk, S.F. et al. The Beclin 1-VPS34 complex – at the crossroads of autophagy and beyond. Trends Cell Biol. 20, 355-362 (2010)
2. Yang, S. et al. Pancreatic cancers require autophagy for tumor growth. Gene. Dev. 25, 717-729 (2011)
3. Tumbull, B.W and Daranas, A.H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry? J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003)