使用差示扫描量热法指导和加速蛋白质治疗的工艺研发

简介

在目前的诊断或治疗应用中，γ 同型免疫球蛋白，特别是人源 IgG₁ 的生产和纯化是十分常规的。 在过去十年，基于 IgE 的治疗也得到迅速发展 (1-3)。 IgE 对于宿主防御寄生虫和防御性炎症非常重要。 IgE 介导的经其受体的信号通路还是发炎性过敏疾病的焦点 (4)。 IgE 的恒定区是同源二聚体，包含三个独特的 Ig 折叠结构域（Cε2、Cε3 和 Cε4），并负责结合它的两个受体 — FcεRI 和 CD23，又称作 FcεRII（图 1）。

本应用报告聚焦在差示扫描量热法 (DSC) 在指导 IgG 和 IgE 的生物治疗研发工艺的多个方面的应用。 DSC 可在不使用标记和人工探针的情况下快速研究蛋白质去折叠过程。 该方法可以在蛋白质去折叠时确定样品吸收的热量，从而衡量其热稳定性以及指示其长期稳定性。

需要特别指出的是，此处所述的工作表明 DSC 有助于了解 IgG 和 IgE 药物产品的处理、纯化及配方策略。 圆二色谱 (CD) 对治疗性蛋白研究的贡献与 DSC 进行了对比。 使用 DSC 可在多结构域蛋白质内部的单个结构域层面上研究蛋白质稳定性，在这方面圆二色谱很难获得有用的数据。

图 1：IgG 和 IgE 示意图

材料和方法

实验使用 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 进行。

按参考文献 (5) 所述制备纯化的 Fcε、Fcγ 和 Fcγ-Cε2 蛋白质。 整组毛细管 DSC 实验，超过 400 多次不同 pH 值条件下的扫描，在为期四个月的时间内完成，而所花精力很少。。 准备 Fcε 和 Fcγ 的实验大约花费三个小时，包括蛋白质浓度测量、稀释和平板准备。 实验剩下的部分由 MicroCal VP-Capillary DSC 自动完成。 参考文献 (5) 中提供了完整的详情。

结果

Fcγ 和 Fcε 的 pH 依赖的去折叠

对于很多在工业环境中进行的亲和蛋白质纯化工艺，在较宽的 pH/盐范围内保持稳定性是先决条件。 对异常 pH 或盐条件较差的耐受性会导致蛋白质聚合或不发挥功效。 Fcε 对各种 pH/盐条件的耐受性是为含有 IgE/Fcε 的蛋白质确定合适、可扩展的纯化方案的重要信息。 为了研究 pH 对 Fcε 二级结构的影响，在 pH 为 4.5 至 7.4 时获得了缓冲液条件下的蛋白质的 CD 光谱。

在 pH 介于 5.2 和 7.4 之间时，Fcε 的光谱相同，且在 216 nm 和 217 nm 之间有单个最小值，这指示重要的 β 折叠和典型的 Ig 结构域。 在 pH 为 5 时，Fcε 光谱则以无规卷曲的方向迁移（最小值移向 200 nm），在 pH 为 4.5 时，光谱显示蛋白质以无规卷曲为主 (5)。 根据 pH 依赖的去折叠，我们研究了 Fcε 在 pH 为 7.0 和 4.5 之间时稳定性是否减弱。

通过远紫外 CD 监控 Fcε 在各种 pH 值条件下的热变性。 在 pH 7.0 条件下，三个结构域 (Cε2-4) 的去折叠过程有一个跃迁。 在 pH 6.0 条件下观察到类似的跃迁，但表观 T_m 下降 1°C。 Fcε 在 pH 5.2 条件下的热诱导去折叠产生更宽的跃迁，比中性 pH 条件下开始的温度低 6°C。 只有在 pH 4.8 条件下两个跃迁才清晰可见 (5)。

根据最初的 CD 结果，使用 DSC 对 Fcε 和 Fcγ 进行更详细的 pH 依赖稳定性研究。 结果发现，Fcε 和 Fcγ 的去折叠跃迁都是不可逆的，且与扫描速率相关（数据未显示），表明不可逆的聚合影响两种蛋白质的表观 Tm 值 (6,7)。 与使用 CD 所能确定的信息不同，DSC 实验表明 Fcε 在所有低于 8.0 的 pH 条件下都有两个独立的去折叠跃迁（图 2A）。 这些跃迁中的其中一个在 pH 较低且 NaCl 浓度高时稳定性减弱，但另一个不会。

图 2：15 mM NaCl 条件下 (A) Fce 和 (B) Fc 的 pH 依赖 DSC 曲线。 经过 American Society of Biochemistry and Molecular Biology（美国生物化学和分子生物学学会）的许可，转载自参考文献 (5)。

正如使用 CD 获得的结构数据所预期的那样，pH 敏感跃迁中涉及的结构域在 pH 4.5 条件下完全去折叠，表明 DSC 不仅对了解折叠结构域的稳定性非常重要，同时对研究折叠状态也有重要作用。 结果显示，Fcγ（来自 IgG₁）通过两次单独的跃迁去折叠；低温跃迁属于 Cγ2 结构域，高温跃迁属于 Cγ3 结构域（图 2B）。 Cγ2 跃迁通过去糖基化对其热稳定性的影响鉴定（结果未公开），Cγ3 跃迁则通过异常高的热稳定性鉴定 (8)。 两种 Fcγ 结构域都表现出对 pH 和 NaCl 的敏感性。 与 Fcε 不同，Fcγ 结构域在 pH 降到 3.0 以下后才发生完全去折叠，说明了为什么抗体在 pH 值低于 3.5 时从蛋白质 A 介质洗脱，以及为什么阳离子交换层析对 IgG 而言是合适的纯化方法（图 3）。

图 3：(A) Fcγ 和 (B) Fcε 结构域热稳定性的 pH 依赖性（以 Tm 值表示）。 经过 American Society of Biochemistry and Molecular Biology（美国生物化学和分子生物学学会）的许可，转载自参考文献 (5)。

离子强度对稳定性的影响

在高浓度盐条件下，Fcγ 的 Cγ2 和 Cγ3 结构域以及 Fcε 的 Cε3 和 Cε4 结构域不稳定。 这可以通过在 5.0 和 7.0 之间的中间 pH 范围条件下对比 150 mM 和 750 mM NaCl 相对于 15 mM NaCl 中的 Tm 值看出（图 3A）。 在此 pH 范围内，这些微小的稳定性差别不可能对 Fcγ 的体外半衰期造成重大影响，因为 Cγ2 和 Cγ3 结构域的 T_m 仍保持在 60°C 以上。

通过使用 Fcγ-Cε2 融合蛋白质进行 DSC 实验，可确定 Fcε 的 pH 敏感结构域是受体结合结构域（Cε3 和 Cε4）。 Fcγ-Ce2 和 Fcε 的一个结构域在 pH 为 2.5 时保持稳定折叠（图 4）。 根据上文所述的实验可以知道，Fcγ 结构域在 pH 低于 3.0 后发生完全去折叠。 通过默认值，鉴定出 Fcε 的 Cε2 结构域为 pH 不敏感结构域。 Fcε 在 pH 4.5 条件下发生限制性蛋白质水解确认了这些结果 (5)。

图 4：对同一种 pH 2.5 磷酸缓冲液透析后的 Fcε（蓝线）和 Fcγ-Cε2（红线）样品的 DSC 曲线。 DSC 曲线上方显示了 Fcε 和 Fcγ-Cε2 蛋白质的示意图。 经过 American Society of Biochemistry and Molecular Biology（美国生物化学和分子生物学学会）的许可，转载自参考文献 (5)。

在高浓度盐条件下，Fcε 的 Cε2 结构域的热稳定性略有增加。 Cε2 在中性 pH 和 750 mM NaCl 条件下尤其稳定，T_m 比 15 mM NaCl 条件下测得的 T_m 高 7°C（图 3B）。 相比之下，在 pH 为 5 和 6 之间时，NaCl 会显著降低 Cε3Cε4 结构域的稳定性（图 3B）。 在低浓度盐环境下，Cε3Cε4 在 pH 为 5.0 时开始去折叠。 在高浓度盐环境下，去折叠跃迁改变 0.5 个 pH 单位，变为 pH 5.5，排除了使用阳离子交换层析作为 IgE 或 Fcε 包含蛋白质的纯化步骤的可行性。

结论

在本研究中，我们证明了 Fcε 具有不寻常的 pH 敏感性，导致受体结合结构域在比 Fcγ 高 2 个 pH 单位（即 pH 5.0）的情况下去折叠。 通过 DSC 确定的 Fcε 的 pH/盐敏感性为选择适合 IgE 包含蛋白质的纯化策略、处理程序和配方提供了有价值的信息，并表明标准 IgG 步骤并不适用。 Fcγ 的 pH 稳定性数据还暗示了在标准亲和纯化（例如最常见的在蛋白质 A 介质上） 过程中（包括低 pH 洗脱和保留等步骤）发生的 IgG 时间依赖性聚合的一种可能机制。

致谢

本应用报告由加利福尼亚州圣地亚哥 Biogen Idec 的 Stephen Demarest 博士友情提供。

参考文献：

1. Zhu, D. et al. A novel human immunoglobulin Fcγ Fcε bifunctional fusion protein inhibits Fcε RI-mediated degranulation. Nature Med. 8, 518–521 (2002).
2. Zhu, D. et al. A chimeric human-cat fusion protein blocks cat-induced allergy. Nature Med. 11, 446-449 (2005).