使用差示扫描量热法指导和加速蛋白质治疗的工艺研发

本文阐述了如何使用该方法检验多结构域蛋白质中单个结构域的稳定性,并为抗体和其他蛋白质的工艺研发提供指导。

简介

在目前的诊断或治疗应用中,γ 同型免疫球蛋白,特别是人源 IgG1 的生产和纯化是十分常规的。 在过去十年,基于 IgE 的治疗也得到迅速发展 (1-3)。 IgE 对于宿主防御寄生虫和防御性炎症非常重要。 IgE 介导的经其受体的信号通路还是发炎性过敏疾病的焦点 (4)。 IgE 的恒定区是同源二聚体,包含三个独特的 Ig 折叠结构域(Cε2、Cε3 和 Cε4),并负责结合它的两个受体 — FcεRI 和 CD23,又称作 FcεRII(图 1)。

本应用报告聚焦在差示扫描量热法 (DSC) 在指导 IgG 和 IgE 的生物治疗研发工艺的多个方面的应用。 DSC 可在不使用标记和人工探针的情况下快速研究蛋白质去折叠过程。 该方法可以在蛋白质去折叠时确定样品吸收的热量,从而衡量其热稳定性以及指示其长期稳定性。

需要特别指出的是,此处所述的工作表明 DSC 有助于了解 IgG 和 IgE 药物产品的处理、纯化及配方策略。 圆二色谱 (CD) 对治疗性蛋白研究的贡献与 DSC 进行了对比。 使用 DSC 可在多结构域蛋白质内部的单个结构域层面上研究蛋白质稳定性,在这方面圆二色谱很难获得有用的数据。

图 1:IgG 和 IgE 示意图
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材料和方法

实验使用 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 进行。

按参考文献 (5) 所述制备纯化的 Fcε、Fcγ 和 Fcγ-Cε2 蛋白质。 整组毛细管 DSC 实验,超过 400 多次不同 pH 值条件下的扫描,在为期四个月的时间内完成,而所花精力很少。。 准备 Fcε 和 Fcγ 的实验大约花费三个小时,包括蛋白质浓度测量、稀释和平板准备。 实验剩下的部分由 MicroCal VP-Capillary DSC 自动完成。 参考文献 (5) 中提供了完整的详情。

结果

Fcγ 和 Fcε 的 pH 依赖的去折叠

对于很多在工业环境中进行的亲和蛋白质纯化工艺,在较宽的 pH/盐范围内保持稳定性是先决条件。 对异常 pH 或盐条件较差的耐受性会导致蛋白质聚合或不发挥功效。 Fcε 对各种 pH/盐条件的耐受性是为含有 IgE/Fcε 的蛋白质确定合适、可扩展的纯化方案的重要信息。 为了研究 pH 对 Fcε 二级结构的影响,在 pH 为 4.5 至 7.4 时获得了缓冲液条件下的蛋白质的 CD 光谱。

在 pH 介于 5.2 和 7.4 之间时,Fcε 的光谱相同,且在 216 nm 和 217 nm 之间有单个最小值,这指示重要的 β 折叠和典型的 Ig 结构域。 在 pH 为 5 时,Fcε 光谱则以无规卷曲的方向迁移(最小值移向 200 nm),在 pH 为 4.5 时,光谱显示蛋白质以无规卷曲为主 (5)。 根据 pH 依赖的去折叠,我们研究了 Fcε 在 pH 为 7.0 和 4.5 之间时稳定性是否减弱。

通过远紫外 CD 监控 Fcε 在各种 pH 值条件下的热变性。 在 pH 7.0 条件下,三个结构域 (Cε2-4) 的去折叠过程有一个跃迁。 在 pH 6.0 条件下观察到类似的跃迁,但表观 Tm 下降 1°C。 Fcε 在 pH 5.2 条件下的热诱导去折叠产生更宽的跃迁,比中性 pH 条件下开始的温度低 6°C。 只有在 pH 4.8 条件下两个跃迁才清晰可见 (5)。

根据最初的 CD 结果,使用 DSC 对 Fcε 和 Fcγ 进行更详细的 pH 依赖稳定性研究。 结果发现,Fcε 和 Fcγ 的去折叠跃迁都是不可逆的,且与扫描速率相关(数据未显示),表明不可逆的聚合影响两种蛋白质的表观 Tm 值 (6,7)。 与使用 CD 所能确定的信息不同,DSC 实验表明 Fcε 在所有低于 8.0 的 pH 条件下都有两个独立的去折叠跃迁(图 2A)。 这些跃迁中的其中一个在 pH 较低且 NaCl 浓度高时稳定性减弱,但另一个不会。

图 2:15 mM NaCl 条件下 (A) Fce 和 (B) Fc 的 pH 依赖 DSC 曲线。 经过 American Society of Biochemistry and Molecular Biology(美国生物化学和分子生物学学会)的许可,转载自参考文献 (5)。
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正如使用 CD 获得的结构数据所预期的那样,pH 敏感跃迁中涉及的结构域在 pH 4.5 条件下完全去折叠,表明 DSC 不仅对了解折叠结构域的稳定性非常重要,同时对研究折叠状态也有重要作用。 结果显示,Fcγ(来自 IgG1)通过两次单独的跃迁去折叠;低温跃迁属于 Cγ2 结构域,高温跃迁属于 Cγ3 结构域(图 2B)。 Cγ2 跃迁通过去糖基化对其热稳定性的影响鉴定(结果未公开),Cγ3 跃迁则通过异常高的热稳定性鉴定 (8)。 两种 Fcγ 结构域都表现出对 pH 和 NaCl 的敏感性。 与 Fcε 不同,Fcγ 结构域在 pH 降到 3.0 以下后才发生完全去折叠,说明了为什么抗体在 pH 值低于 3.5 时从蛋白质 A 介质洗脱,以及为什么阳离子交换层析对 IgG 而言是合适的纯化方法(图 3)。

图 3:(A) Fcγ 和 (B) Fcε 结构域热稳定性的 pH 依赖性(以 Tm 值表示)。 经过 American Society of Biochemistry and Molecular Biology(美国生物化学和分子生物学学会)的许可,转载自参考文献 (5)。
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离子强度对稳定性的影响

在高浓度盐条件下,Fcγ 的 Cγ2 和 Cγ3 结构域以及 Fcε 的 Cε3 和 Cε4 结构域不稳定。 这可以通过在 5.0 和 7.0 之间的中间 pH 范围条件下对比 150 mM 和 750 mM NaCl 相对于 15 mM NaCl 中的 Tm 值看出(图 3A)。 在此 pH 范围内,这些微小的稳定性差别不可能对 Fcγ 的体外半衰期造成重大影响,因为 Cγ2 和 Cγ3 结构域的 Tm 仍保持在 60°C 以上。

通过使用 Fcγ-Cε2 融合蛋白质进行 DSC 实验,可确定 Fcε 的 pH 敏感结构域是受体结合结构域(Cε3 和 Cε4)。 Fcγ-Ce2 和 Fcε 的一个结构域在 pH 为 2.5 时保持稳定折叠(图 4)。 根据上文所述的实验可以知道,Fcγ 结构域在 pH 低于 3.0 后发生完全去折叠。 通过默认值,鉴定出 Fcε 的 Cε2 结构域为 pH 不敏感结构域。 Fcε 在 pH 4.5 条件下发生限制性蛋白质水解确认了这些结果 (5)。

图 4:对同一种 pH 2.5 磷酸缓冲液透析后的 Fcε(蓝线)和 Fcγ-Cε2(红线)样品的 DSC 曲线。 DSC 曲线上方显示了 Fcε 和 Fcγ-Cε2 蛋白质的示意图。 经过 American Society of Biochemistry and Molecular Biology(美国生物化学和分子生物学学会)的许可,转载自参考文献 (5)。
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在高浓度盐条件下,Fcε 的 Cε2 结构域的热稳定性略有增加。 Cε2 在中性 pH 和 750 mM NaCl 条件下尤其稳定,Tm 比 15 mM NaCl 条件下测得的 Tm 高 7°C(图 3B)。 相比之下,在 pH 为 5 和 6 之间时,NaCl 会显著降低 Cε3Cε4 结构域的稳定性(图 3B)。 在低浓度盐环境下,Cε3Cε4 在 pH 为 5.0 时开始去折叠。 在高浓度盐环境下,去折叠跃迁改变 0.5 个 pH 单位,变为 pH 5.5,排除了使用阳离子交换层析作为 IgE 或 Fcε 包含蛋白质的纯化步骤的可行性。

结论

在本研究中,我们证明了 Fcε 具有不寻常的 pH 敏感性,导致受体结合结构域在比 Fcγ 高 2 个 pH 单位(即 pH 5.0)的情况下去折叠。 通过 DSC 确定的 Fcε 的 pH/盐敏感性为选择适合 IgE 包含蛋白质的纯化策略、处理程序和配方提供了有价值的信息,并表明标准 IgG 步骤并不适用。 Fcγ 的 pH 稳定性数据还暗示了在标准亲和纯化(例如最常见的在蛋白质 A 介质上) 过程中(包括低 pH 洗脱和保留等步骤)发生的 IgG 时间依赖性聚合的一种可能机制。

致谢

本应用报告由加利福尼亚州圣地亚哥 Biogen Idec 的 Stephen Demarest 博士友情提供。

参考文献:

1. Zhu, D. et al. A novel human immunoglobulin Fcγ Fcε bifunctional fusion protein inhibits Fcε RI-mediated degranulation. Nature Med. 8, 518–521 (2002).
2. Zhu, D. et al. A chimeric human-cat fusion protein blocks cat-induced allergy. Nature Med. 11, 446-449 (2005).

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