在数分钟内计算出病毒滴度

在本应用报告中,我们介绍马尔文(Malvern)的NanoSight仪器如何利用纳米颗粒跟踪分析技术来对噬菌体和病毒进行直接观察、计数和测定大小

简介

在通常情况下,噬菌体和病毒颗粒的滴度通过噬菌斑测定法确定,或者在动物细胞病毒的情况下,通过基于细胞的生物测定法确定。 在这些阵列系统中,感染性病毒颗粒都在融合性细胞层中生长,以产生噬菌斑(被破坏细胞区域),可通过计算噬菌斑的个数来确定空斑形成单位(pfu)的个数。 虽然这给出了个别感染性病毒颗粒的直接计数,但非感染性病毒颗粒并不产生噬菌斑,并且含有许多病毒颗粒的聚合体只会产生单个的噬菌斑。 很多情况下,制造商需要知道备制样品中病毒颗粒的个数(无论是感染性还是非感染性),以及备制样品在保质期内的团程度(若有)。

纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)允许在液体中实时地直接或单独观察纳米级颗粒,如病毒和病毒团聚物,从而获得高分辨率的粒度分布。 该技术快速、可靠、精确且成本低,是对现有纳米颗粒分析方法(如:动态光散射法(DLS)、光子相关光谱(PCS)或电子显微术(EM))很好的补充。

马尔文仪器有限公司(Malvern Instruments)的NanoSight系列产品利用NTA技术分析液体中直径10 nm~2000 nm的颗粒。 NTA同时利用光散射和布朗运动的特性来获得悬浮液中颗粒的粒度分布。 激光光束穿过样本室并沿该光束散射光的路径穿过悬浮液中的颗粒,从而能够轻松地观察到它们。 然后用斯托克斯-爱因斯坦(Stokes-Einstein)方程式计算每个单独颗粒的大小。 结果显示为单个颗粒的粒度与数量图(或粒度与 相对散射光强图)。

图1. 粒度与 相对颗粒散射光强与 浓度三维图。
MRK1985-01_Fig_1

疫苗生产/开发

必须证明(验证)病毒疫苗制剂的稳定性,且包含特定比例的活性组分。 NTA允许快速直接地估算产品纯度和浓度。 类似地,可以利用NTA技术测定病毒制剂中团聚物形成的程度和速度,从而允许制造商开发更好的产品制造工艺,并优化产品保质期。

由于NTA能够对制剂中的所有颗粒进行观察和测定大小,这样就可以用比传统的TCID50或噬菌斑测定法更短的时间来获得有关纳米颗粒含量的其他信息。 例如,较大颗粒的存在(利用NTA技术既可以测定大小也可以计数)既可以表示来自细胞培养过程的非病毒细胞碎片,也可以表示含有许多单个端病毒体的病毒颗粒的团聚物。

无论在什么情况下,这种团聚物/污染物对于制造商来说都代表一种可能的问题,这种问题可以通过马尔文的NanoSight系统快速识别出来。

图2. 马尔文的NTA仪器生成的典型病毒图像。
MRK1985-01_Fig_2

病毒清除研究

病毒清除效果通过精心准备的高滴度病毒刺突样本进行测试(应用不同类型也会不同)。 然后用它们来解决适合作为清除步骤的工艺步骤。 数据必须通过纯净的非团聚病毒刺突材料,该材料必须以高滴度制备,并在使用前储存起来。 NTA可以非常理想地确定储存前后的聚合状态。

病毒提纯

马尔文的NanoSight仪器系列快速确定一种病毒制剂包含污染物或团聚物的程度以及量化其水平的能力,这种检测被证实对于有兴趣优化病毒制剂提纯过程的开发商是十分宝贵。 例如,图3显示了部分纯化的病毒制剂(白线)和已经成功通过可有效去除所有污染物或团聚物的相同样品(红线)之间的差异。 注意,纵轴表示粒子浓度(病毒粒子/mL)。

图3: 病毒制剂最后一步提纯前(白色)后(红色)的粒度分布叠加图。
MRK1985-01_Fig_3

基于噬菌体的MRSA保护—“噬菌体疗法”

通过NTA进行病毒粒子检测和计数正为斯特拉斯克莱德大学制药与生物医学科学研究所(IPBS)的研究人员们提供着必要的信息。 该团队主要开发利用天然细菌对抗抗药性金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。 MRSA(或抗药性金黄色葡萄球菌)是金黄色酿脓葡萄球菌的变种,可抵抗大多数抗生素,使其非常难以治疗,且可能致命。 虽然这种“超级细菌”可以用清洁剂灭杀,但清洁剂的稀释和使用通常是不一致且无效的,使得噬菌体疗法成为一种极具吸引力的选择。 噬菌体疗法涉及到使用噬菌体在宿主细胞内复制然后再溶解宿主细胞来破坏其宿主细菌。

这正是IPBS荣誉讲师Mike Mattey博士带领的团队 利用NTA技术进行的特征化噬菌体培养中的做法。 在将噬菌体作为干覆层来保护高风险的细菌入侵部分(缝合线、手术器械和伤口)前,培养液需要进行测定,并评估其浓度。 NTA技术使该团队能够实时地以低成本快速观察病毒培养及测定大小。 “病毒群的特征描述需要对20 nm~1000 nm范围内的聚合体进行评估” Mattey博士说。 “NanoSight可快速、方便地提供量化的样本特征描述。 此外,NanoSight技术可提供支持计数结果的可靠的粒子群观察。”

讫今为止,已成功地分析了大量的病毒类型,包括:

  • 腺病毒
  • 巨细胞病毒(MCMV)
  • 猪乳头瘤病毒
  • λ-噬菌体(肠杆菌λ-噬菌体)
  • 烟草花叶病毒(TMV)
  • 白血病病毒(MuLV)
  • 日本乙型脑炎病毒(JEV)
  • 氰基病毒
  • 单纯性疱疹病毒
  • 流感病毒
  • 杆状病毒
  • M13
  • M14

(Carr, B. (2009) Nanoparticle tracking analysis: direct visualization for counting and characterizing virus particles in liquids, Meeting the challenge of viral pandemics, 2009 - biotech-online.com)

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