采用光散射技术的葡聚糖表征

Zetasizer Nano是通过光散射技术来测量葡聚糖的大小,并用于估测分子量。 静态光散射用来计算MW平均重量并与SEC/GPC作比较

简介

葡聚糖是一种复杂的多糖,可应用于各种领域,如制药、摄影、农业和食品行业。 许多葡萄糖分子 (C6H12O6) 结合成具有短枝链(大部分只有一个或两个糖单位,小于 5%,参见图 1) 的长度不一的链。 葡聚糖可由蔗糖在细菌的作用下合成(如肠膜状明串珠菌和变异链球菌),也可由其它细菌和酵母制成。

在本应用报告中,使用两种光散射技术,在一个角度、一种浓度下实现葡聚糖表征。 多糖的尺寸和分子量通常作为色谱校准的标准值。

图 1: 重复的葡聚糖单位的分子结构
mrk839 图 1

实验

多糖聚合体具有不同的链长;窄分子量的各种聚合碎片现可应用于商业领域。 葡聚糖碎片可溶于水和电解溶液中,形成 pH 值各异、高浓度的透明、稳定的溶液。 还存在其它溶液,特别是二甲硫、甲酰胺、乙二醇和甘油,但是多糖不溶于一元醇(如甲醇、乙醇、异丙醇)和大部分酮(如丙酮、二甲基酮)。

在去离子水中准备三种不同的分子量标准(Pharmacosmos A/S 提供的葡聚糖-5、12 和 25),浓度为 5 g/L。 然后使用孔径大小为 0.1um 的薄膜(Whatman 注射器过滤膜)即可方便地过滤样品。 碎片的标称摩尔质量为5220、11600 和 23800 g/mol。

使用动态光散射(DLS)技术,在 Zetasizer Nano S中测量样品。

结果

所有样品溶液清晰可见,无肉眼可见的缔合或痕迹,表明葡聚糖已较好地溶解。 即使在最小粒度(葡聚糖-5)的情况下,光散射设置的灵敏度也足以提供重要的散射信号,以供分析。

流体动力学尺寸

分析由分子的布朗运动造成的动态光散射(DLS)强度波动,确定扩散系数,并依此确定流体动力学尺寸。 该技术仅需要了解溶液(水)的粘度和温度。 实验结果由总体平均粒度、Z 平均和总体多分散指数(PDI)组成,通过累积或单指数拟合计算而来(数据见表 1汇总结果)。

表1:流体动力学尺寸和估算的葡聚糖摩尔质量
mrk839_表1

可以从多指数方法中获得分布信息,无需假设任何分布形状。 按强度显示的粒度分布信息叠加曲线见图2。

图2: 测量的葡聚糖-5 ( – ), 葡聚糖-12 ( – ), 和葡聚糖-25 ( – ) 的粒度分布
mrk839 表 2

粒度分布和 Z 平均结果可以用来估算线性多糖经验模型的分子质量。 预计值列在表1中。

多分散性信息

聚合体的分布分析一般以 Mw/Mn 的形式提供。 在光散射中,光散射强度是直接测量的数值,间接通过结果的转换,能获得体积甚至是数目分布。 由于转换过程中涉及到粒径3次方(体积分布)和粒径6次方(数量分布)的转化,因此应慎重对待结果:仅对高质量的相关函数数据执行该操作。 由于葡聚糖基本满足 GPC 标准,因此可进行转换。
对于每个分布(强度、体积和数量),均可从软件和表 2 列出的数值中获得平均值和多分散指数。 结果表明,葡聚糖-25的多分散指数最低,这表明葡聚糖-25是所有标准中单分散性最好的分子。 这一点也可以从规格数据中得到确定。

表2:粒度和估算的葡聚糖分子质量,分布分析
mrk839_表 2

为了比较这些葡聚糖的规格和光散射结果,可使用 Mw/Mn 参数。 这通常称为高分子化学的多分散性。 此处 Mw/Mn 值 1.64、1.54、1.47 与葡聚糖-5、葡聚糖-12 和葡聚糖-25 的 1.60、1.43、1.30(GPC)吻合。 预计的经验模型依存关系是:

PDI ~ ( Mw/Mn - 1 )2

测量的分子量

在静态光散射(SLS)中,绝对MW 一般是通过探测若干个已知浓度的样品的散射强度确定的。 在此,使用单一浓度方法和葡聚糖在水中的第二维里系数(根据Malvern 应用报告 MRK577-01: 0.011 mol mL / g2)的已知值:调节测量的强度(如表 1)以适用于水溶液(25Kcps/s)、使用甲苯调节(237.1Kcps/s),以及使用 dn/dc=0.150 mL/g #计算Kc/R。

SLS 测量得到的分子量(如表 3 所示)可接近于供应商提供的标称 Mw。

表 3:葡聚糖的静态光散射结果(单一浓度)
mrk839_表 3

总结

通过动态和静态光散射来表征葡聚糖的特性,以获得分子量和多分散性信息。 实验结果与凝胶渗透色谱法测得的样品规格完全吻合。

参考文献:

# 高分子和生物分子科学家的折射率增量数据手册,A. Theisen, C. Johann, M.P. Deacon, S.E. Harding, 诺丁汉出版社,(2000)

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