用新的 waveRAPID 动力学分析突破药物命中结果发现的界限

总结

药物发现数千种化合物的高通量筛选活动可以产生大量显示出与药物靶点具有潜在相互作用的命中结果。可以从许多高通量分析的稳态分析中获得结合亲和力。为了选择那些具有进一步研发潜力的命中结果，需要对结合动力学进行全面表征。这可以鉴别出以有利的动力学结合率特异性达到所需靶标的化合物。在实践中，这意味着必须对大量筛选命中化合物进行广泛的动力学研究。迄今为止，这是一项极其耗时和耗费材料的工作。必须从数百种命中化合物中制备合适的系列稀释物，每种浓度都必须重复进样。Creoptix 开发了一种新技术，可以使此类项目更加高效，能够从单一浓度的样品中获得可靠的动力学表征。Creoptix waveRAPID 在 Creoptix WAVE 上代表了筛选设置中动力学测量的范式变化。

在这项由我们的客户 Idorsia Pharmaceuticals Ltd 的 HTS 药物研发小组开展的当前研究中，我们展示了 waveRAPID 在简化大量药物命中化合物的动力学表征方面的能力。在多项实验中，通过 waveRAPID 测定了多达 146 种命中化合物的结合动力学，使用单一浓度的样品脉冲进样到预先固定在传感器基质上的药物靶标上。所有被分析的化合物之前都在最先进的 SPR 仪器上使用传统多循环动力学测量进行了研究。 

比较从两种技术中获得的数据，发现计算的离解常数 (K_D) 具有极好的相关性，仅存在少数异常值。这一发现验证了 Creoptix WAVE 上的 waveRAPID 技术在早期药物发现中的应用，能够在高通量筛选设置中生成深入的动力学数据。由于表征每种化合物的时间缩短至仅几分钟，因此可以节省大量时间和材料。与目前最先进的 SPR 仪器相比，确定数百种化合物的结合动力学的大型活动可以在几天而非几星期内完成。 

此外，在整个分析系列中，即使对于困难的化合物（如那些显示大体积折光率作用或缓慢解离的化合物），waveRAPID 技术也能生成可靠的数据。这类化合物通常需要表面再生和配体蛋白的再固定。这在使用传统多周期分析的大型测量活动中会导致工作流程中断。最后，Creoptix WAVE 以及新的 waveRAPID 方法使分析设置变得非常简单，可从每个样品的单一浓度进行全面的结合动力学分析。此外，Direct Kinetics 是 Creoptix 基于统计参数估计的独特而新颖的评估引擎，它提供了一个自动化且稳健的分析工作流程，包括真实的统计误差计算。waveRAPID 技术和 Direct Kinetics 自动评估引擎是一个强大的组合包，有可能改变当今早期药物研发中进行动力学结合分析的方式。

材料和方法

Creoptix 实验方案

在负载 Ni²⁺ 离子的 4PCP-NTA WAVEchip 上捕获组氨酸标记的靶标蛋白 1 和组氨酸标记的靶标蛋白 2，密度为 4000 - 5000 pg/mm²。在 10 μm 样品溶液中进行化合物的脉冲 waveRAPID 进样，持续 25 秒，随后缓冲液进样 250 秒，每个流动池的流速为 32.5 μL/分钟。所有测量均在含有 0.05% 吐温 20 和 5% DMSO 的 50 mM 磷酸盐缓冲液中进行。通过减去参比通道和空白进样的信号，对数据进行双重参比。使用与化合物样品相同的进样参数，用添加了额外 0.5% DMSO 的运行缓冲液的脉冲进样来校准 6 次进样脉冲中传感区域中化合物的表观浓度。由 Direct Kinetics 评估引擎使用 1:1 结合模型进行动力学分析。

Biacore 研究方案

在使用 Ni²⁺ 离子激活的 Ni-NTA 芯片上捕获组氨酸标记的靶标蛋白 1 和组氨酸标记的靶标蛋白 2，密度为 4000 - 5000 pg/mm²。通过在运行缓冲液（含 0.05% 吐温 20 和 5% DMSO 的 50 mM 磷酸盐缓冲液）中进行系列稀释，将分析物调节至所需浓度。在结合时间为 100 秒、解离时间为 250 秒、流速为 40 μL/分钟的条件下获得了传感图。为了确定结合动力学（k_on、k_off 和 K_d），通过 Biacore T200 Evaluation 软件使用 1:1 结合模型分析了双重参比后获得的传感图。

结果

在本研究中，针对最先进的仪器和方法学，验证了新的 waveRAPID 技术用于类似筛选情形下快速获取动力学结合数据的能力。如图 1 所示，通过单一浓度每个样品的脉冲进样，可以快速生成大量筛选命中化合物的动力学结合数据。包括分析物解离，每次测量大约需要 5 分钟。waveRAPID 生成的典型反应曲线如图 1 中的图 A 和图 B 所示（数据用红色表示，动力学 1:1 模型用黑色表示）。评估的参数显示在图 C 的速率图中（整个分析中进样的对照化合物以黑色圆圈表示），显示出极好的重现性。表 1 列出了典型的测定时间和样品通量，比较了两个靶标上 384 个样品测定示例。 

图 1：GCI 在 Creoptix WAVEdelta 上的应用，用于使用新 waveRAPID 技术的早期药物命中结果发现和表征。在使用 waveRAPID 的筛选情形下，可以从单一浓度进样的化合物中实现全动力学表征，从而在早期药物命中结果发现中节省大量时间和成本。
(a) 从筛选的 80 种化合物中选出了具有代表性的 waveRAPID 反应曲线。
(b) 使用 WAVEcontrol 中可选预设的定制进样设置，可以覆盖整个亲和力范围。在此，使用中间结合物的设置（20 秒脉冲进样，250 秒解离），使亲和力的分辨率范围为低纳摩尔到低微摩尔水平。
(c) 动力学速率显示在速率图中，在对角线上有相同的亲和力。圆圈中的数据点显示了对照化合物在整个分析中具有良好重现性。

表 1：将 waveRAPID 在 WAVEdelta 上与最先进的技术 (Biacore T200, 8k) 用于对 2 个靶标的 384 个样品进行全动力学表征的示例分析运行时间和样品通量对比。

对获得的动力学数据进行筛选，找出结合率的误差（低于 100% 绝对 k_a 和低于 50% 绝对 k_d）,并与标准 SPR 多循环测量数据进行比较。如图2所示，与传统 SPR 多循环测量的比较揭示了两个数据集之间具有非常好的相关性。 

图 2：在 Creoptix WAVEdelta 上用 waveRAPID 测量的药物筛选命中结果结合动力学对在 Biacore T200 仪器上进行的传统多循环动力学测量获得的值作图。对 waveRAPID 数据进行筛选，以消除低于 100% 结合率 (k_a) 和低于 50% 解离率 (k_d) 的计算速率参数。该相关性证实 waveRAPID 动力学方法的速度比传统方法快 10 倍。

为了进一步挑战该系统，我们进行了另一系列测量，在整个检测过程中，使用了在传统多循环测量中导致工作流程中断和表面再生的更具难度的化合物。据推测，由于分析物与目标蛋白的接触时间显著缩短，这些困难的分子（表现出高体积反应或缓慢解离）不会扰乱 WAVE 上的整体工作流程，并且使得任何间歇性表面再生变更为不再必要。如图 3 所示，几乎所有关注化合物的动力学结合参数仍然可以获得可靠评估，误差很小，阳性对照仍然显示出具有很高重现性。

图 3：在分析中再次测量 30 种之前表征过的化合物，该分析还包含 30 种更具挑战性的化合物（均显示出高体积折光率 [RI] 作用或缓慢解离），以及在整个试验中进样的具有挑战性的化合物。具有挑战性的化合物导致传统多循环动力学的主要工作流程受限，使得定期表面再生成为必要，而 waveRAPID 可以实现连续无人值守测量时间的无缝工作流程。由 Creoptix Direct Kinetics 估计引擎确定的绝对计算结合和解离率常数百分比的统计误差分别在水平轴和垂直轴上绘制。在之前分析中没有表现出困难行为的化合物（绿色标记）以及对照化合物的复制物（紫色标记），可以通过低误差清楚地加以识别。此外，由于大的体积折射率贡献，在以前的分析中显示困难的化合物可以在低误差（蓝色标记）的波上稳健地分析。此外，由于大体积折光率的作用，在之前分析中表现出困难的化合物可以在 WAVE 上得到稳定分析且误差较低（蓝色标记）。其余难以分析的化合物明显存在较大误差（红色标记）。

结论

与传统的多循环动力学分析相比，WAVEsystem 具有高灵敏度、解析极快相互作用的能力和 waveRAPID 分析技术，能够在更短的时间内对大量药物命中化合物进行动力学表征。通过在一次进样中从单孔中获得动力学数据，减少了试剂和样品消耗，对早期药物研发大有裨益。此外，waveRAPID 还提供：

• 与传统 SPR 相当的结果但耗时明显更短
• 减少接触时间，保留靶标蛋白，使更长时间的不间断检测成为可能
• 高重现性和结果可靠性
• 基于相关参数从单次进样到选择命中结果的结合动力学
• 以天而非星期为单位表征更多的相互作用
• 精深的统计误差计算，发现相关命中结果并筛选出有问题的化合物

关键要点

• 减少样品接触时间可在更长运行时间内保持靶标完整性
• 单次进样即可获得结合动力学
• 可重复性好，可与传统 SP 技术相媲美

非常适合：

• 粗混合物筛选：小分子、片段和肽
• 快速完成命中结果到先导化合物的进展
• 先导物优化
• 不稳定靶标
• 困难化合物
  

致谢

我们感谢 Geoffroy Bourquin、Laksmei Goglia、Solange Meyer 和 Oliver Peter 进行了所有实验并为本文件做出了贡献。