粗反应混合物的筛选

简介

片段筛选已经成为药物研发过程中识别初始命中化合物的一种有效方法。其中心特征为筛选少量（1000 个）低分子量（通常 <250 Da）化合物与目标结合。这些化合物的小尺寸意味着它们更有可能结合，但亲和力较弱，并且可以使用多种不同的生物物理方法（包括 Creoptix 传感器）。识别与大多数靶点上的大多数结合位点结合的片段相对简单。挑战是在开始优化药物性质之前，将片段生长成具有更高亲和力的更大的命中化合物。

假设化合物（分析物，A）与目标（配体，L）结合的亲和力呈简单平衡：

其中 k_d 为解离率或离解率，k_a 为缔合率或结合率，平衡解离常数或亲和力 (K_D) 为 k_d / k_a 的比值。在许多情况下，当对化合物的修饰导致较慢的解离率时，亲和力发生改善。这是一项一级速率常数，因此与浓度无关。

传统的优化方法需要单独的反应来合成每种化合物，然后在分析中测量亲和力之前，还需要纯化并配制确定浓度的化合物。Vernalis 开创了一种筛选粗反应混合物 (CRM) 的方法，可以极大地提高合成的速度并降低成本，以探索提高化合物亲和力的机会。对于命中化合物，通常以孔板形式平行进行一系列反应，改变引入命中化合物的取代基。在最小的处理后，随后单独评估所得的粗反应混合物与靶点结合的解离率的变化——解离率的变化表明已经获得亲和力提高的化合物。此类解离率筛选 (ORS)¹ 的初步示范使用 Biacore 技术，以证明在材料、相关废弃物处理和时间方面的效率改进。此外，在项目早期阶段，当对结构-活性关系 (SAR) 的理解可能较低时，可以对更多的化合物进行快速排序。

可靠地检测解离率变化的能力是此方法的关键。专有的格栅耦合干涉测量 (GCI) 技术比传统技术（如表面等离子体共振 [SPR]）提供了更高灵敏度，允许可靠地确定高达 10s^-1 的解离率。此外，Creoptix WAVE 的无堵塞微流控允许使用多种溶剂（包括乙腈和高浓度 DMSO），增加了可用于粗反应混合物的化学物质的范围。

在这篇技术说明中，我们比较了 Creoptix WAVE 的 ORS 结果和 Vernalis 之前使用 Biacore 仪器获得的结果，回顾性地使用了针对两个靶点的相同 CRM 库，这两个靶点分别为丙酮酸脱氢酶激酶 2（aa16-407，下文称为 PDHK2）和热休克蛋白 90α 的 N 端 ATP 酶结构域（aa9–236，下文称为 Hsp90）。Vernalis 以前已经鉴别出一系列有效的 ATPASS GHKL 家族成员抑制剂 ^2,3,4。

材料和方法

粗反应混合物 (CRM) 解离率筛选。对八十三 (83) 个 CRM 和一个纯化的对照化合物在 WAVEdelta 上的解离率进行了筛选。在捕获目标蛋白前，将 A PCH-NTA WAVEchip 负载氯化镍。然后在约 7000 pg/mm² 下将双 His6 标记的 HSP90 和双 His6 标记的 PDHK2 蛋白分别捕获至通道 2 和通道 3。通道 1 和通道 4 负载镍，并被用作参比通道。在 250 μL/分钟的恒定流速下，以约 20 μM 浓度的 HBS-P + 1% DMSO 的溶液进样 CRM，进样持续 30 秒。允许离解 120 秒。使用 WAVEcontrol 软件进行解离率测定。

纯化化合物动力学

PCH-NTA WAVEchip 负载 0.5 mM NiCl² 后捕获蛋白。HSP90 和 PDHK2 在密度约 3500 pg/mm2 的 HBS-P 缓冲液中被捕获。将 VER235377（纯化物）以 30 μL/分钟进样到 HBS-P + 1% DMSO 中，增加浓度范围从 27.4 nM 至 20 μM（7 个浓度，3 倍稀释）。在 60 秒的解离阶段之前，允许进样 60 秒。在 25°C 下进行所有相互作用分析，并使用 WaveControl 软件对数据进行评估。采用 Langmuir 1:1 模型进行数据拟合，确定动力学参数。

结果

Vernalis 率先使用解离率筛选 (ORS) 在 Hit-to-Lead（命中结果到先导化合物）化学领域进行动力学取样 ¹。他们在化学信息学、化合物库合成和表面等离子体共振 (SPR) 分析方面的专业知识对这项基准研究具有吸引力，并使未纯化反应产物 (CRM) 的 ORS 成为可能。CRM 筛选从片段命中结果中快速鉴别先导化合物，无需纯化化合物库或使用蛋白质结构。采用 WAVEdelta（基于 GCI 技术）和 Biacore T200（基于 SPR 技术）对两种技术进行了 ORS 比较研究。具体而言，在 WAVEdelta 上测量选定的化合物，并与来自 Vernalis 的回顾性测试（在 Biacore T200 上进行）CRM 库进行比较。 

图 1 显示了选定 CRM 的解离率确定示例。在两项实验中，Creoptix WAVEdelta 得到的结果与 Biacore T200 得到的结果一致。对于解离率大于 1s^-1 的化合物，WAVEdelta 能可靠地解析出快速解离常数 (k_off)。

图 1：选定 CRM 的解离率筛选。在 Biacore T200（左图）或 Creoptix WAVEdelta（右图）上进行测量。GCI 数据再现 SPR 数据，并能以比 1s^-1 更快的速度准确和更可靠地确定相互作用的解离率

此项解离率筛选研究可以获得相同的 PDHK2 选择性命中结果鉴别，也可在 WAVEdelta 上表征为纯化化合物 (VER235377)。动力学参数与结合亲和力结果和基于 SPR 的 Biacore T200 获得结果相似。图 2 显示了 GCI Creoptix WAVEdelta（右图）和 SPR（Biacore T200，左图）获得的数据。最后，我们鉴别确定了相同的 PDHK2-选择性命中化合物 (VER235377) ^2,4。获得的动力学数据见表 1。

	kon (M-1.s-1)	koff (s-1)	Rmax (pg/mm2)	KD (nM)
HSP90 Biacore T200	1.92x105	0.130	24.1	679
HSP90 WAVEdelta	1.82x105	0.122	25.2	669
PDHK2 Biacore T200	6.10x105	0.116	18.3	191
PDHK2 WAVEdelta	3.16x105	0.052	14.5	166

表 1：纯化化合物物 VER235377 对 HSP90 和 PDHK2 的动力学数据

图 2：纯化化合物 VER235377 的结合动力学数据。在 Biacore T200（左图）或 Creoptix WAVEdelta（右图）上进行测量。HSP90 和 PDHK2 蛋白获得的数据相当

简而言之，利用 Creoptix WAVE，我们能够：

• 确认之前使用 Biacore T200 报告和测量的 PDHK2 命中结果 ^2,4
• 确认相同的 PDHK2-选择性命中结果 VER235377，并对其完全纯化的形式进行表征
• 确认 VER235377 PDHK2 对 HSP90 的选择性
• 对解离率远高于 1s^-1 的化合物显示出极佳分辨率，突出了 Creoptix WAVE 解析快速解离率的能力

结论

Creoptix WAVE 提供的动力学数据与 Biacore T200 的测量结果非常一致，如回顾性测量的 Vernalis 化合物活动对丙酮酸脱氢酶激酶 2 (PDHK2) 和热休克蛋白 90 (HSP90) 的作用结果所示。Creoptix WAVE 具有高灵敏度和快速解析相互作用的能力，改进了化合物筛选和小分子动力学分析，以加速药物开发，并显著降低与靶点和化合物纯化相关的成本。因此，WAVE 是筛选弱结合物库的理想之选，这些弱结合物库显示非常快的解离率（如小分子、片段、肽等）。结合无堵塞微流控技术，可以对粗的、未纯化反应混合物进行研究，WAVE 正在革命性地加快药物研发过程。

关键要点

用 Creoptix WAVE 系统快速捕获粗反应混合物中的弱结合化合物。

• 与粗反应混合物相容的无堵塞微流控：非常适合解离率筛选和基于片段的药物设计
• 与 SPR 历史数据相当的数据：GCI 技术提供了与 SPR 仪器相似的动力学数据
• 可以出色解析高于 1 s^-1 的解离率：快速转换时，WAVEsystem 可以测量高达 10 s^-1 的解离率

非常适合：

• 粗混合物解离率筛选：小分子、片段和肽
• 快速完成命中结果到先导化合物的进展
• 先导物优化

参考文献

1. Murray, J.B. et al.2014.Off-Rate Screening (ORS) By Surface Plasmon Resonance.An efficient method to kinetically sample hit to lead chemical space in unpurified reaction products.J. Med.Chem.57, 2845-1850 doi: /10.1021/jm401848a
2. Brough, P.A. et al.2017.Application of Off-Rate Screening in the Identification of Novel Pan-Isoform Inhibitors of Pyruvate Dehydrogenase Kinase.J.Med.Chem., 60, 6, 2271–2286. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01478
3. Brough, P. A. et al.2009.Combining hit identification strategies: fragment-based and in silico approaches to orally active 2-aminothieno[2,3-d]pyrimidine inhibitors of the Hsp90 molecular chaperone.J. Med.Chem.52, 4794–4809 doi: 10.1021/jm900357y
4. Baker, L .M. et al.Rapid optimization of fragments and hits to lead compounds from screening of crude reaction mixtures.Commun Chem 3, 122 (2020).doi: 10.1038/s42004-020-00367-0

致谢

我们感谢 Natalia Matassova 博士 (Vernalis) 进行的所有实验，以及 Roderick Hubbard 教授对本技术说明的贡献。