Rh 或 Rg：哪一个更适合我的 GPC/SEC 样品？

by Kyle Williams, Wednesday, 25th September 2019

使用 凝胶渗透/体积排阻色谱 (GPC/SEC) 的主要目标通常是确定大分子样品的分子量。多检测器系统，如马尔文帕纳科的OMNISEC 和 TDAmax 系统，能够提供一系列其他分子表征参数，包括分子尺寸。在某些情况下，如分析蛋白质或其他已知分子量的样品时，分析的唯一目的是确定样品的分子尺寸。在这些情况下，分子尺寸可以揭示关于样品分子结构的关键信息，这通常与样品的最终功能或应用密切相关。

通过 GPC/SEC 分析可以获取两种常见的分子尺寸测量：流体动力学半径 (Rh) 和回旋半径 (Rg)。以前的一篇文章描述了如何使用Rh 和 Rg 在蛋白质表征中应用，采用动态光散射 (DLS) 和小角 X 射线散射 (SAXS)。本文将讨论 Rh 和 Rg 的定义，如何在 GPC/SEC 环境中计算这两者，以及这些差异的实际影响。有关本文主题的更多详细信息（以及更多方程式！），请参阅这些链接的文档。

Rh 和 Rg 的定义

在不深入数学内容的情况下（暂时），样品的 Rh 是一个假想球体的半径，该球体具有与从样品的分子量和本体粘度计算出的质量和密度相同的特性。而 Rg 代表分子成分到分子质量中心的均方根距离。GPC/SEC 分析生成的单一 Rh 和 Rg 数值是在每个数据分片计算值的重量平均值。类似于重量平均分子量 (Mw)，这些值是最适合对样品进行整体表征的。值得注意的是，与 GPC/SEC 仪器解耦的多角度光散射 (MALS) 检测器在批量模式下提供了 z 平均 Rg 值 Rgz。

如何计算 Rh 和 Rg

现在，我们稍微探讨一下数学。基于爱因斯坦描述球形颗粒溶液粘度的模型，Rh、分子量 (M) 和本体粘度 ([η]) 之间的关系如下所示（NA 是阿伏伽德罗常数）。relationship between IV, MW, & Rh由于 GPC/SEC 直接计算每个数据分片的分子量和本体粘度，因此可以轻松地使用此方程式确定 Rh。因此，Rh 计算的下限与在折射率 (RI)、光散射和粘度计通道中有足够检测器响应的最小样品分数一致。

从 GPC/SEC 计算 Rg 有两种选择。最直接和常用的方法是观察散射光强度随观察角度的变化。这需要具有至少两个角度的光散射检测器来观察样品的角度依赖性。

Rg calculation from partial Zimm plots
图1. 小分子的部分 Zimm 图显示各向同性散射（左）和大分子的角度依赖性（右）

正如在之前对 Rh 和 Rg 的讨论以及最近的一篇关于关于光散射检测器的文章中提到的，很难使用 GPC/SEC 确定蛋白质的 Rg，因为蛋白质一般小于 10-15 nm，因此是各向同性散射体，即它们向各个方向散射光的强度相同。低分子量聚合物也是各向同性散射体，这意味着得到的部分 Zimm 图是平坦且斜率为零的，因此不能为这些较小的材料确定 Rg。如图1左侧所示。

为了通过光散射计算 Rg，分子必须显示角度依赖性，这意味着散射光的强度随观察角度而变化。这将导致具有斜率的部分 Zimm 图，如图1右侧示例所示。光散射检测器中使用的光波长影响样品显示角度依赖性的尺寸阈值，因此通过调整光源波长，可以在较小尺寸范围内计算 Rg。

计算 Rg 的另一种方法是使用下面显示的 Flory-Fox 方程，该方程将分子量 (M) 和本体粘度 ([η]) 与 Rg 关联起来（Φ0 被视为常数）。relationship between IV, MW, & Rg这种方式计算 Rg 的优点是，如同 Rh 的计算，计算下限取决于检测器响应而不是样品是否显示角度依赖性。缺点是 Φ0 实际上依赖于样品、溶剂和研究的分子结构（最适合用于随机线团），因此将其设为常数会引入某种程度的近似性。总的来说，在本文中，当讨论 Rg 时，它是通过光散射检测器计算得出的。

Rh 和 Rg 数据的差异

给定分析的 Rh 和 Rg 数据取决于具体的样品。由于 Rg 的计算要求分子显示角度依赖性，如果样品是展示了各向同性散射的样品，则有可能不能确定 Rg。具有宽分子量和分子尺寸分布的样品可能会包含展示角度依赖性的较大部分和不展示角度依赖性的较小部分。在这种情况下，只能为较早洗脱的较大分子计算 Rg。

limits of Rh and Rg calcuations
图2. 三重检测器色谱图，叠加计算的 Rh 和 Rg 值

一个突出这种行为的例子如图2所示。数据中 Rh 和 Rg 值直接计算的部分分别由深绿色和洋红色曲线的实线段表示。线的虚线部分表示 Rh 和 Rg 值被外推的区域。样品可以计算的最小 Rg 值为 11.55 nm，这表示样品后期洗脱分段太小而无法显示角度依赖性。这将 Rg 外推用于样品的大部分。在对比中，Rh 可以计算到 5.08 nm，使得样品的大多数分段的分子尺寸可以直接计算。

由于 Rh 和 Rg 代表的是样品的独立属性，因此不应期望得到的值是相同的。这并不意味着其中一个是错误的！对于给定的样品类型和溶剂，Rh 和 Rg 之间可能会有一致的关系。根据我对聚合物样品的经验（因为很难获得蛋白质的 Rg 数据），计算的 Rg 通常与确定的 Rh 相同量级，但略大一些（在图2的例子中，Rh = 13.62 nm; Rg = 14.19 nm）。这并不一定适用于所有情况，因为 Rh 和 Rg 之间的关系取决于分子结构。

分子尺寸对科学家来说出于多种原因是重要的。我鼓励您以最适合您的样品的方式使用可以获得的数据。当您下次展示 GPC/SEC 数据时，有人询问 Rh 和 Rg 之间的差异时，您将准备就绪！

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